[发明专利]一种黑麦草胚性愈伤组织的筛选和保存方法

说明书

技术领域

本发明属于细胞工程组织培养技术领域，具体涉及一种获得黑麦草(Lolium L.)胚性愈伤组织及其再生能力保持的方法，并涉及相关的黑麦草愈伤组织诱导、离体再生等。

背景技术

黑麦草属植物中，广泛栽培的是多年生黑麦草(Lolium perenne L.)和一年生黑麦草(Lolium multiflorum L.)，在世界各地均有种植，在我国属于引进栽培，是优良的牧草和草坪草，因此利用转基因技术对其进行遗传改良，具有重要意义。

转基因技术最重要的基础，是组织培养技术。目前对黑麦草的遗传转化，大多数是对其愈伤组织进行转化，然后筛选、分化，从而获得转基因植株。因此，获得具有分化能力的愈伤组织，是最终获得再生植株的关键。

黑麦草属单子叶禾本科植物。单子叶植物愈伤组织诱导，通常使用幼胚作为外植体，这样获得的愈伤组织具有较高的分化率，如小麦、玉米、水稻、大麦等。然而黑麦草成熟种子胚非常小，直径约0.5～1.0mm；幼胚更小，直径不足1.0mm，而且受季节限制，取材非常困难。因此黑麦草诱导愈伤组织，通常是以成熟种子胚为外植体【马欣荣博士论文，2006，四川大学；Bajaj S等，2006；专利(马欣荣，CN200510020540.7ZL)】。

植物组织诱导愈伤组织的能力，以及愈伤组织的分化再生能力，存在品种间、个体间的差异。从黑麦草成熟胚诱导的愈伤组织，品种不同，存在较大差异，约有10～80％的愈伤组织不能分化再生成植株，并且随着愈伤组织继代时间增加，分化能力随之下降。继代一年的愈伤组织，几乎不能再生出苗。这亦是转基因研究的瓶颈之一。

因此，探索一种能获得较高分化率、能分化再生出植株的胚性愈伤组织，并且以一种方式能长期保存胚性愈伤组织的方法，非常必要。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种能长期保存具有分化再生能力的黑麦草愈伤组织的方法，为多年生黑麦草遗传改良、新材料的创造和培育，以及基因功能研究打下基础。

本发明提供了一种长期保持黑麦草愈伤组织再生能力的方法，包括如下几个步骤：愈伤组织诱导和继代培养、愈伤组织分化再生、植株继代、再生植株茎节分生组织区愈伤组织二次诱导、愈伤组织二次分化再生、植株的长期继代保存等步骤，其特征是：愈伤组织诱导所用的材料是黑麦草的成熟种子胚；愈伤组织继代培养后分化再生并淘汰不能分化的愈伤组织；再生植株继代培养后取分生组织区进行第二次愈伤组织诱导；二次诱导的愈伤组织进行分化再生，并再次淘汰不能分化的愈伤组织。这样获得的植株可以进行长期继代保存。在需要愈伤组织进行相关研究时，取这样的植株茎节分生区再次诱导的愈伤组织，经过2～4次继代培养后，具有很高的分化能力，分化能力维持在80～100％。简言之，本方法是通过对重复筛选胚性愈伤组织后获得的植株，进行长期继代培养，来保存胚性愈伤组织的。在整个培养过程中，植物生长调节剂的添加非常重要。

具体而言，在本发明的方法中可以使用的黑麦草包括，例如，多年生黑麦草品种5个，多福、雅晴、顶峰、匹克、百舸；一年生黑麦草1个，特高。这些品种均可购自市场。取出这些黑麦草的成熟胚，在含5～7mg/L的2，4-D和0.1mg/L的KT的诱导培养基上诱导出愈伤组织。

将诱导出的愈伤组织继代培养4次，2周/次，共2月。然后在含有0.1mg/L的2，4-D和0.5mg/L的6-BA的分化再生培养基中进行愈伤组织分化再生，1月后筛选，淘汰不能分化的愈伤组织。将分化再生出来的植株转移到试管中进行继代培养，植株在含有1～2mg/L的6-BA继代培养基中扩增培养2次，2周1次，1月。

在第一次分化再生及继代扩增繁殖完成后，本发明的方法进一步包括对再生植株进行第二次愈伤组织诱导及继代培养的步骤。这一次诱导，是取植株茎节的分生组织区为外植体进行愈伤组织的再次诱导，诱导培养基同上。诱导培养时间为1月。之后继代培养4次，2周1次，共2月。

之后，本发明的方法还包括第二次分化再生。将上一步骤中获得的愈伤组织转接到分化培养基中，分化培养基同上，再次进行愈伤组织的分化再生，培养1次，1月后筛选，淘汰不能分化的愈伤组织。将再次分化再生出来的植株转移到试管中进行继代培养。这样获得的植株可以进行长期的继代培养。继代方法为2周1次，继代培养基同上。

之后，本发明还包括，在经过1年以上的长期继代培养，取其植株茎节分生区再次诱导愈伤组织，经过2～4次继代培养后，2周/次，具有很高的分化能力，分化能力维持在80-100％。