[发明专利]一种产碱杆菌及利用其制备D-对羟基苯甘氨酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及产碱杆菌及其用途，更具体地说是涉及一种产碱杆菌以及利用该产碱杆菌制备D-对羟基苯甘氨酸的方法。

背景技术

D-对羟基苯甘氨酸是一种重要的医药原料，用于合成β-内酰胺类抗菌素类药物，如羟氨苄青霉素、头孢克罗、头孢立新、头孢拉定等抗菌药物。这些药物对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、弓形体、螺旋体等均有杀灭作用，在临床医学上被广泛应用,对很多常见病的治疗起着重要的作用。已有技术制备D-对羟基苯甘氨酸方法有两种：化学合成法和酶法。化学合成法的缺点是：工艺复杂、成本高、对环境污染严重。酶法制备D-对羟基苯甘氨酸与化学合成法相比具有工艺简单、产品收率高、能源消耗少、环境污染小等优点，是目前最经济的工业生产方法。生物酶法制备D-对羟基苯甘氨酸可以分为酶拆分法和酶转化法两种方法。酶拆分法以化学法制备的乙酰化DL-HPG为底物,利用氨基酰化酶进行拆分。酶转化法以DL-对羟基苯海因为底物,利用海因酶将底物转化为D-对羟基苯甘氨酸。酶拆分法的缺点是：1、产物收率低，最高不超过50%；2、必须事先合成消旋的乙酰化DL-HPG底物，工艺复杂。酶转化法制备D-对羟基-苯甘氨酸是利用微生物体内产生的D-海因酶DHase将DL-对羟基苯海因水解成为N-氨甲酰对羟基苯甘氨酸NC-D-p-HPG，然后用化学法或氨甲酰水解酶将NC-D-p-HPG水解脱去氨甲酰基得到D-对羟基-苯甘氨酸。酶转化法理论上能将底物100%地转化为单一对映体的氨基酸，但是现在能够以高产率和高光学纯度实现上述转化制备D-对羟基苯甘氨酸的微生物菌种还很少。所以发明一种能够促进酶转化法制备D-对羟基苯甘氨酸的微生物菌种和利用该微生物菌种制备D-对羟基苯甘氨酸的方法是十分必要的。

发明内容

本发明的目的是提供一种促进酶转化法制备D-对羟基苯甘氨酸的微生物新菌种和利用该微生物新菌种制备D-对羟基苯甘氨酸的方法。

本发明的目的是这样实现的：

一种产碱杆菌Alcaligenes sp.SHNU01, 菌种保存号CGMCC NO.3872。

采用上述产碱杆菌作为催化剂制备D-对羟基苯甘氨酸的方法，包括下列步骤：

（1）取产碱杆菌Alcaligenes sp. SHNU01，CGMCC NO.3872 细胞置于pH值为6～10的磷酸钾缓冲溶液或Tris-HCl缓冲溶液中；

（2）向步骤（1）缓冲溶液中加入浓度为10～200 mM的消旋体海因，反应温度20～50℃，反应时间3～96小时，得 N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸；

（3）将步骤（2）反应液与NaNO ₂ 反应后分离、纯化得D-对羟基苯甘氨酸。

步骤（1）中所述产碱杆菌细胞浓度为湿重5～100 g /L。

步骤（2）中所述消旋体海因为对羟基苯海因。

本发明的要点是：从土壤中分离并经过多轮筛选后获得的新的产碱杆菌，该产碱杆菌菌种于2010年5月24日在中国普通微生物菌种保藏中心保藏，保藏号为CGMCC3872；并利用该产碱杆菌的催化作用选择性水解反应制备D-对羟基苯甘氨酸。

本发明的具体实施方法是：

1、菌种的富集：

富集：将取自各地的土样加入到10ml无菌水中，均匀搅拌，待部分沉降后取约1mL上部混合液加入富集培养基中，于28℃，200r/min恒温振荡培养约48h。

分离：将经富集培养得到的菌液稀释适当浓度，各取0.2mL涂布于分离培养基上，28℃培养直到长出足够大的菌落。

纯化：挑取生长良好、菌落大小、形态、颜色不一的菌落划线接种于普通细菌培养基平板上进行纯化；挑取典型单菌落，反复纯化，得到纯种。 

2、菌种的筛选：

 双层琼脂法筛选：