[发明专利]使用单倍体交配策略在酵母中合成异聚多亚基多肽的方法

说明书

发明背景 

重组蛋白生产是高通量筛选、功能验证、结构生物学、和药物多肽生产的一项必需工作。大肠杆菌是广泛用于表达异源蛋白的生物体，因为它易于在便宜的培养基上生长至高细胞密度，且具有完善建立的遗传技术和表达载体。然而，这对高效生产活性生物分子并非总是足够的。为了保持生物学活性，多肽链必需折叠成正确的天然三维结构，包括适当形成二硫键，而且可能还需要正确联合多种链。 

尽管蛋白质的活性状态在热力学上可能是有利的，然而折叠的时间量程可以由几毫秒至几天变化。例如对亚基和亚结构域排列的需要导入了动力学屏障。而且，特别是真核蛋白，为了形成正确折叠的蛋白质，必需发生共价反应。后一类反应包括二硫键的形成、脯氨酸肽键周围多肽链的顺式/反式异构化、前蛋白质(preprotein)的加工、和辅基的连接。这些动力学限制可能导致部分折叠中间物的积聚，而它们所包含的暴露的疏水性“粘性”表面促进自我结合和集合体的形成。 

抗体是在临床诊断和治疗中具有许多用途的四聚体蛋白质。每个抗体四聚体由两条相同的轻链和两条相同的重链组成。特定类型的纯粹人源或人源化抗体难以或不可能由天然来源纯化足够数量以用于许多目的。结果是，生物技术和制药公司转向通过基于重组DNA的方法来进行大规模制备。功能抗体的生产不仅需要合成两种多肽，而且需要许多翻译后修饰，包括N端分泌信号序列的蛋白水解加工；多肽正确折叠和组装成四聚体；二硫键的形成；和特定的N-连接糖基化。所有这些事件都发生在真核细胞分泌途径中，即真核细胞独特的细胞器联合体。 

这些复杂蛋白质的重组合成必需依赖基于高等真核组织培养的系统来获得生物学活性物质。然而，基于哺乳动物组织培养的生产系统显著比微生物发酵方法更加昂贵和复杂。另外，关于使用衍生自动物副产品的物质来生产治疗性产品仍然存在怀疑。 

作为真核细胞，巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)具有高等真核表达系统的许多优点，诸如蛋白质加工、蛋白质折叠、和翻译后修饰，同时又像大肠杆菌或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)那样易于操作。它比其它真核表达系统诸如杆状病毒或哺乳动物组织培养要更快、更容易、且更便宜，而且通常得到更高表达水平。作为酵母，它享有与糖酵母属一样的分子和遗传操作优势。这些特点使得毕赤氏酵母成为非常有用的蛋白质表达系统。 

为糖酵母属开发的许多技术可应用于毕赤氏酵母属，包括互补转化、基因破坏、和基因取代。另外，用于糖酵母属的命名法已应用于毕赤氏酵母属。糖酵母属和毕赤氏酵母属二者基因产物之间还存在交叉互补。来自糖酵母属的几种野生型基因补足了毕赤氏酵母属的对应突变基因。 

在巴斯德毕赤氏酵母中进行的异源表达可以是胞内的或分泌的。分泌要求所表达蛋白质上存在信号序列，从而将它靶向分泌途径。尽管已经成功使用了几种不同的分泌信号序列，包括一些异源蛋白上存在的天然分泌信号，然而结果是易变的。异源蛋白分泌的一项潜在优势是巴斯德毕赤氏酵母分泌天然蛋白的水平很低。考虑到毕赤氏酵母基本生长培养基中蛋白质的数量很低，这意味着所分泌异源蛋白占据了培养基中总蛋白质的极大部分，并且作为蛋白质纯化的第一步。 

许多酵母物种(包括毕赤氏酵母属)是能够进行交配的。这使得两种不同单倍体菌株能够天然交配并生成具有两个染色体拷贝的二倍体物种。 

尽管巴斯德毕赤氏酵母已经成功用于生产多种异源蛋白，例如乙肝表面抗原(Cregg等，1987，Bio/Technology 5：479)、溶菌酶、和转化酶(Digan等，1988，Dev.Indust.Micro.29：59；Tschopp 等，1987，Bio/Technology 5：1305)，然而在毕赤氏酵母中生产其它异源基因产物的努力(尤其是通过分泌)得到了不同的结果。在目前对巴斯德毕赤氏酵母表达系统的理解水平，不能预测是否能够在这种酵母中将给定基因表达到明显水平，或者毕赤氏酵母是否能够耐受在它的细胞中存在重组基因产物。另外，尤其难以预报特定蛋白质是否会由巴斯德毕赤氏酵母分泌，以及效率如何(如果分泌的话)。 

本发明提供了用于由能交配的酵母(包括毕赤氏酵母属物种)分泌异源异多聚体的改进方法。 

发明概述 

本发明提供了用于在能交配的酵母中合成和分泌重组异聚多亚基蛋白的方法。目的异聚多亚基蛋白包含至少两种不同的多肽链，例如抗体的重链和轻链、MHC的α和β链、诸如此类。为每一种不同多肽链提供表达载体。