[发明专利]一种应用pH-区带精制逆流色谱分离去氢紫堇碱的方法

说明书

技术领域

本发明涉及应用pH-区带精制逆流色谱从元胡粗提物中分离高纯度去氢紫堇碱的方法。

背景技术

元胡为罂粟科(Popaveraceae)植物延胡索的干燥块茎,是浙八味中的一种。在传统中国医药中，延胡索被认为可活血，行气和减轻所有类型的疼痛。元胡的主要活性成分为生物碱，去氢紫堇碱为元胡季铵碱中的一种，现代药理研究表明，去氢紫堇碱可以提高小鼠的耐缺氧能力，改善微循环，治疗心肌缺血，另有研究表明，去氢紫堇碱还可用于治疗溃疡和冠心病。

目前，去氢紫堇碱的分离主要有柱层析（张晓丽，曲扬，侯家鸣，等. 延胡索的化学成分[J]，沈阳药科大学学报， 2008，25(7)：537-540），但分离效率低且有死吸附；也有用制备型高效液相色谱进行分离（杨杰，白雪，肖海涛，等. 延胡索中去氢紫堇碱对照品的制备及含量测定[J]，时珍国医国药，2009，20(4)：1000-1002），但上样量小且有死吸附；另外还有应用标准高速逆流色谱进行分离（S. Q. Tong, J. Z, Yan, J. Z, Lou. J. Liq. Chromatogr. & Related Tech. 2005, 28 (18): 2979-2989），但上样量太小。pH-区带精制逆流色谱（pH-zone-refining counter-current chromatography）是在标准高速逆流色谱基础上发展起来的特殊逆流色谱分离制备技术，与标准高速逆流色谱相比，其突出的特点是在固定相中加入了保留酸（或碱），在流动相中加入了洗脱碱（或酸），样品中各组分依据其酸碱性及疏水性的不同而实现分离，目标组分以矩形峰被洗脱出来，而杂质则被富集在矩形峰边缘，并且不同组分被洗脱出来伴随着pH值的变化。pH-区带精制逆流色谱继承了标准高速逆流色谱高效，对固定相无污染，样品回收率高等优点，同时具有分离容量大、组分被高度浓缩等优点。目前，pH-区带精制逆流色谱已广泛的用于生物碱、肽类及其衍生物、异构体等的分离。

发明内容

本发明的目的是提供一种应用pH-区带精制逆流色谱分离去氢紫堇碱的方法，该方法工艺简单，分离效率高。

本发明采用的技术方案如下：

一种应用pH-区带精制逆流色谱分离去氢紫堇碱的方法，所述的方法包括以下步骤：

（1）在分液漏斗中分别加入氯仿、甲醇、水以体积比为1.5～3:1～1.5:1组成的溶剂体系，充分振摇后静置分层，取上相加入终浓度为10～20mM（优选10mM）的无机酸作为固定相，下相加入终浓度为10～20mM（优选10mM）的碱作为流动相；

（2）取元胡的乙醇粗提物用固定相溶解，所述的固定相加入量为25～60ml/g元胡的乙醇粗提物，溶解后制得样品溶液；

（3）取固定相注满逆流色谱仪的分离柱，随后注入样品溶液，待进样完成后，开启速度控制器，使分离柱正转，在750～850r/min转速下，以1.5～2.5ml/min的流速持续注入流动相，以波长190～400nm的紫外检测器检测，用自动部分收集器收集洗脱液，薄层层析跟踪检测至洗脱液中无去氢紫堇碱组分，停止收集；

（4）将步骤（3）中收集得到的洗脱液通过薄层层析和高效液相进行检测，合并与去氢紫堇碱标准品R_f值及保留时间相同且去氢紫堇碱纯度大于90%的洗脱液，用旋转蒸发仪回收溶剂，得到去氢紫堇碱。

所述步骤（3）中，所述样品溶液的进样的体积通常小于分离柱柱体积的30%。

所述步骤（2）中，元胡的乙醇粗提物还可以用固定相和未碱化的下相溶解，所述的方法包括以下步骤：

（1）在分液漏斗中分别加入氯仿、甲醇、水以体积比为1.5～3:1～1.5:1组成的溶剂体系，充分振摇后静置分层，取上相加入终浓度为10～20mM的无机酸作为固定相，下相加入终浓度为10～20mM的碱作为流动相；

（2）取元胡的乙醇粗提物用固定相和未碱化的下相溶解，所述的固定相加入量为25～60ml/g元胡的乙醇粗提物，所述的未碱化的下相加入量为0～50ml/g元胡的乙醇粗提物，溶解后制得样品溶液； 0是指未碱化的下相的加入量无限接近于0但不为0；

（3）取固定相注满逆流色谱仪的分离柱，随后注入样品溶液，待进样完成后，开启速度控制器，使分离柱正转，在750～850r/min转速下，以1.5～2.5ml/min的流速持续注入流动相，以波长190～400nm的紫外检测器检测，用自动部分收集器收集洗脱液，薄层层析跟踪检测至洗脱液中无去氢紫堇碱组分，停止收集；