[发明专利]一种乙酰胆碱酯酶的提取方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种乙酰胆碱酯酶的提取方法及其应用，更具体地说是涉及一种用于果蔬农药残留量测定的乙酰胆碱酯酶的提取方法。

背景技术

有机磷和氨基甲酸酯类农药因具有高效和低残留的优点而被广泛应用于果蔬生产中，但果蔬中农药残留可引起人急性中毒死亡，微量积累又会造成慢性中毒如致癌、致畸、致突变等，严重危害人们的身体健康。目前检测农药普遍采用的有色谱法、波谱法和酶抑制法等。色谱法检测准确，但成本高，检测时间长，需要具备一定技术水平的专业人员才能进行操作，只适合在实验室进行；波谱法干扰因素多，灵敏度不高，易出现假阴性结果，一般只能作为鉴别方法粗选；酶抑制法具有操作简便，速度快，适合现场检测和大批样品筛选检测的特点，且不需昂贵的仪器，因此作为一种检测农药的常用方法得到广泛应用。但目前广泛使用的快速测定产品--农药速测试纸，其主要原料乙酰胆碱酯酶依由于制备过程中产品原料和制备工艺复杂的原因，价格昂贵，使对果蔬中农药残留的快速测定产品难以普及应用。

发明内容

本发明的目的是提出一种能用于果蔬中农药残留量快速测定的，工艺简单且生产成本低廉的乙酰胆碱酯酶提取方法。

本发明的技术方案

本发明为一种从家蚕头部中提取乙酰胆碱酯酶的方法，包括以下工艺步骤：

(1)、将家蚕饥饿18-24h后，洗净并吸干表面水分，以1：5的比例剪取家蚕头部于pH7.5～8.0磷酸缓冲液中，冰浴匀浆，匀浆液于4℃、5000-15000 r.p.m离心，取其上清液，即得乙酰胆碱酯酶粗提液；

(2)、用硫酸铵沉淀法纯化乙酰胆碱酯酶

a、在冰浴中边缓慢搅拌乙酰胆碱酯酶粗提液，边加入硫酸铵，使酶液中硫酸铵的饱和度在30-80％的范围内；

b、上述所得溶液于0～4℃、5000～15000 r.p.m冷冻离心，保留沉淀；

c、再加入pH7.5-8.0的磷酸缓冲液小心溶解沉淀，并用pH 7.5-8.0磷酸缓冲液稀释2-10倍；

(3)、用透析法脱硫酸铵

将步骤（2）经过硫酸铵沉淀纯化后的乙酰胆碱酯酶的酶液装入透析袋中，用其体积20-30倍的蒸馏水透析，直至透析液不产生沉淀为止；

(4)、将步骤（3）所得的酶液浓缩，干燥，即得已纯化的乙酰胆碱酯酶制品。。

本发明用于提取乙酰胆碱酯酶的原料采用四龄家蚕或五龄家蚕。

所述方法中的步骤(2)步，即用硫酸铵沉淀法纯化乙酰胆碱酯酶的工艺，经试验表明，使酶液中硫酸铵的饱和度在40-60％的范围内的效果较好。

所述方法中的步骤(4)，可采用真空冷冻干燥机，在0-4℃条件下浓缩酶液至固体。也可采用透析法浓缩酶液，将酶液装入透析袋中，用聚乙二醇6000作干燥剂，于0-4℃下浓缩酶液。

本发明的有益效果

本发明所提供的提取乙酰胆碱酯酶的方法，其原料来源广泛，制备简单稳定，生产成本较低。用本发明方法所制备的乙酰胆碱酯酶产品，产品纯度高，用于对残留农药的检测，具有较高灵敏度，经测定检出极限为95～100μg／mL，且经本发明纯化后的乙酰胆碱酯酶灵敏度比酶粗提液提高4倍以上。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进一步阐述，但并不限制本发明。

乙酰胆碱酯酶的活性测定方法：乙酸-β-萘酯显色法；

即在含有1mL，16mmol/mL底物（乙酸-β-萘酯的丙酮溶液)的试管中，加入经硫酸铵沉淀纯化后的酶液5mL，再加入500、250、100、50μg/mL的甲胺膦溶液1mL，对照加1mL pH7.5磷酸缓冲液，混合均匀，在30℃恒温水浴中保温反应5分钟后，加入显色剂0．5ml (0.8％ 固兰B的3.6％SDS)溶液混合均匀，使其反应5分钟，观察颜色变化，呈红色为完全不被甲胺膦抑制，退色为部分抑制，呈无色为完全被抑制。

实施例1

采用四龄家蚕提取乙酰胆碱酯酶的方法步骤如下：

(1)、将家蚕饥饿24h后，洗净并吸干表面水分，以1：5的比例剪取家蚕头部于pH7.5磷酸缓冲液中，冰浴匀浆，匀浆液于4℃、6000 r.p.m离心30 分钟，取其上清液，即得乙酰胆碱酯酶粗提液；

(2)、用硫酸铵沉淀法纯化乙酰胆碱酯酶

a、取在乙酰胆碱酯酶粗提液10mL，冰浴中边缓慢搅拌乙酰胆碱酯酶粗提液，边加入硫酸铵3.26克（根据硫酸铵饱和度用量表）；