[发明专利]表达羧酸转运蛋白基因的植物表达载体及其在改良苜蓿耐铝性状中的应用

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种植物表达载体及其应用，尤其涉及含有羧酸转运蛋白基因的植物表达载体及其在改良苜蓿耐铝性状中的应用。本发明还涉及基于该植物表达载体的转基因植物的制备方法。

背景技术

在全世界80亿公顷可耕地中，酸性土壤占30％左右，50％以上的耕地为潜在的酸化土壤(von Uexküll and Mutert，1995)。酸性土壤大部分分布在热带和亚热带的发展中国家，该地区酸性土壤约占世界的60％。就我国目前土地资源情况而言，我国南方处热带和亚热带地区，酸性土面积约203.5万km²，占全国总面积的21％。近年由于广泛使用氨肥和半干旱土壤的长期浇水灌溉，也进一步加剧了耕作土壤的酸化进程。铝在地壳中的含量非常丰富，当土壤pH小于5.5时，有毒性的Al³⁺成为主要形式。因此，在酸性土地中常常伴随铝毒害，铝毒成为酸性土壤中限制农作物产量的主要因子(Leon V.Kochian，1995)。

紫花苜蓿(Medicago Sativa L.)简称苜蓿，是优良的多年生豆科牧草，素有“牧草之王”的美称，是目前世界上最主要的生饲料作物之一。它不仅营养丰富品质好、产草量高、适口性好，是家畜的优质饲料；而且其根系发达，根深可达10米以上，可蓄水保土、防风固沙；此外，苜蓿还可通过根瘤固氮，增加土壤氮素，分解磷酸盐、改善土壤理化性质，起到肥田作用。苜蓿喜温暖半干旱气候，对铝害较敏感。近年来，随着我国农业结构调整和南方具有丰富的水热资源，苜蓿种植已大量南移，但长江流域及其以南等广大地区土壤偏酸性，过多的游离铝和交换性铝离子对苜蓿产生毒害，铝毒成为限制苜蓿在南方酸性土壤中生长最主要的因子，因而提高紫花苜蓿的对铝害的耐受性是解决苜蓿南移的关键。

克服铝毒害的常用方法是通过大量施用石灰，提高土壤pH值，使游离铝沉淀，解除铝毒害，但施用石灰仅对表层土壤发挥作用，深层土壤仍呈酸性，难以彻底解决土壤酸度问题，并且在大量酸性土壤中施用石灰既增加农民经济负担，又存在潜在环境问题。相比之下，培育耐铝毒的苜蓿品种是最为经济有效的方法。

植物可通过根系有机酸的分泌来降低铝离子的毒害程度。在铝毒分子生物学方面的研究中，较多集中于改变植物体内有机酸合成途径相关酶类的活性来获得耐铝的转基因植物，并已取得成功的例子。如Fuente等将假单胞菌细胞质柠檬酸合酶(CS)基因在烟草和番木瓜中超量表达，提高了转基因植株的柠檬酸含量并增加了柠檬酸的分泌，从而极大地提高了烟草和番木瓜对铝的抗性。然而，当Delhaize等对Fuente等研究的同种转基因系烟草及高效表达假单胞菌35S-CSB蛋白活性达100倍的转基因系烟草重新进行研究，却没有发现此两种转基因系根系柠檬酸浓度及柠檬酸的分泌与对照相比有所增加，这两种转基因烟草的抗铝性也没有提高。Koyama等也在拟南芥和胡萝卜细胞内高效表达线粒体柠檬酸合酶基因，观察到转基因植株体内柠檬酸浓度及体外柠檬酸分泌量均明显增加，分别改善了转基因拟南芥在缺磷土壤上的生长及转基因胡萝卜细胞在铝-磷酸盐介质中的生长。Tesfaye等通过提高苜蓿根瘤苹果酸脱氢酶(nodule-enhanced MDH，neMDH)活性，使柠檬酸、草酸、苹果酸、琥珀酸及醋酸盐在苜蓿根系中的浓度和分泌量提高，并使转基因苜蓿的耐铝性在水培或土培中都得到明显增强。在通过提高植物体内有机酸合成酶基因的表达改善植物对铝毒的耐受性的同时，也可通过降低植物体内有机酸的分解途径提高植物对铝毒的耐受性。如Kihara等研究表明，降低胡萝卜细胞内分解柠檬酸基因NADP-异柠檬酸脱氢酶(NADP-ICDH)的活性，而使此胡萝卜突变体细胞柠檬酸分泌显著增加。说明通过对植物根系有机酸分泌的影响，可以提高植物对铝毒的耐受能力，将有机酸合成酶基因导入受体植株可提高紫花苜蓿对酸性土壤的耐受性(Mesfin等，2001，罗小英等，2004)。

羧酸转运蛋白(DTC，dicarboxylate-tricarboxylate carrier)参与植物中多种羧酸的转运，能将线粒体内的三羧酸和二羧酸运输到胞质中，有可能会增加根系有机酸的分泌，从而提高植物的耐铝能力。本发明人从适应南方酸性土壤环境生长的柑桔类植物中克隆了编码羧酸转运蛋白基因，并转入饲料作物苜蓿中，得到耐铝形状改良的转基因苜蓿。迄今为止还未见有通过利用编码羧酸转运蛋白的基因创造耐铝苜蓿品种的报道。

发明内容