[发明专利]白藜芦醇二聚体的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生化合成技术领域，具体涉及白藜芦醇二聚体的制备方法。

技术背景

白藜芦醇(resveratrol)是葡萄与葡萄酒中的一种功效成分，分子式为C₁₄H₁₂O₃，相对分子量228.25，化学名称为3，4′，5-三羟基-1，2-二苯乙烯，属于一类具有二苯乙烯母核的化合物——芪类结构的非黄酮类多酚化合物。白藜芦醇具有广泛的生理活性，包括抗动脉硬化、抗氧化、抗菌消炎、抗肿瘤活性、心血管保护作用、抗艾滋病活性、以及免疫调节等。研究表明，白藜芦醇对肺癌、肝癌、肠癌、胃癌、乳腺癌和白血病等均具有拮抗作用。

白藜芦醇二聚体是一类结构复杂、具有多种生物活性的天然化合物，由白黎芦醇以不同方式、不同聚合度聚合而成。目前的研究主要集中在ε-viniferin、δ-viniferin、α-viniferin三种结构上。白藜芦醇二聚体(主指δ-viniferin)具有较强的抗氧化作用，是白藜芦醇抗氧化作用的50倍；同时，其对引起癌变的环氧酶的抑制效果比白藜芦醇更强。

目前，白藜芦醇二聚体的体外合成方法大体分为化学催化剂合成和生物酶催化合成两类。化学催化剂合成主要利用FeCl₃、Ag₂O、VOCl₃、Mn(OAc)₃等金属氧化剂催化合成白藜芦醇二聚体，如：黄开胜等将白藜芦醇溶于甲醇溶液，加入过量的FeCl₃搅拌反应，分别得到ε-viniferin和7a，8a-cis-viniferin，产率分别是20％和2.7％。生物酶催化合成主要利用辣根过氧化物酶、大豆脂肪氧化酶、漆酶等氧化酶合成白藜芦醇二聚体。Lnagckae.P等1977年用辣根酶(horseardish peroxidase)和H₂O₂氧化α-viniferin及反式4-羟基二苯乙烯，得到了系列viniferin类化合物；Nicotra S等用嗜热甲烷八叠球菌和绒毛栓菌产生的漆酶分别与白藜芦醇作用，催化合成δ-viniferin，反应24小时后产量分别为21％和18％。

由于酶催化合成的步骤少，是一种很有前途的仿生合成方法。但是目前酶促合成白藜芦醇二聚体存在的主要问题是氧化酶类专一性较低、反应时间长、转化率普遍不高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种反应时间短、转化率高的白藜芦醇二聚体(viniferin)的制备方法，其合成时间短、工艺条件稳定、转化效率高，适于规模生产。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现。

本发明白藜芦醇二聚体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、酶促合成白藜芦醇二聚体

先将白藜芦醇溶解于质量浓度为20％～50％的丙酮或乙酸乙酯溶液中，加入固定化漆酶，在35℃～45℃条件下反应1～5小时，反应结束后固液分离；将含有固定化漆酶的固相再加至溶解有白藜芦醇的丙酮或乙酸乙酯溶液中继续反应，反复使用，收集反应液，直到固定化漆酶的酶活降低一半后换之。所述的固定化漆酶可选择具有固定化漆酶的多孔烧结玻璃环，其用量为白藜芦醇质量的2～5倍；所述反应的合适反应温度为40℃，反应时间为4小时；

步骤二、分离白藜芦醇二聚体

将收集的反应液用有机溶剂或中性盐沉淀蛋白，固液分离后将液相浓缩，再加入乙酸乙酯萃取，将萃取液再浓缩，干燥后即得白藜芦醇二聚体。所述的有机溶剂优选甲醇、乙醇或是三氯甲烷；所述的中性盐优选硫酸钠、硫酸铵或是硫酸锌。

所述的具有固定化漆酶的多孔烧结玻璃环的制备方法，包括以下步骤：先以CuBr₂为催化剂、2，2’-联吡啶为配体、2-溴丙酸乙酯为自由引发剂，以多孔烧结玻璃环为载体，制备具有甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝聚合功能的多孔烧结玻璃环；再将该多孔烧结玻璃环加至漆酶溶液中，于30℃条件下震荡或搅拌16～24小时后，加入终浓度为1％的戊二醛溶液，室温下交联1小时，过滤后纯水洗涤，去除未吸附的游离酶，再离心去除表面水分，即得具有固定化漆酶的多孔烧结玻璃环。