[发明专利]抗结核杆菌ESAT-6单克隆抗体TBEA8及应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及抗结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶蛋白(ESAT-6)的单克隆抗体的制备及应用，是利用细胞工程、抗体工程技术，获得分泌抗ESAT-6的单克隆抗体的杂交瘤细胞系，通过同品系的小鼠诱导腹水，制备抗EAST-6的单克隆抗体TBEA8，鉴定为IgG2b、κ型，再通过亲和纯化、电泳、免疫等技术实现对该抗体的应用。

背景技术

结核早期诊断技术是一直困扰医学诊断领域的一个重要难题。20世纪，因抗生素研究的发展和广泛应用，人类曾成功地控制了结核病。但是，由于抗药性不断出现与积累，结核分枝杆菌对于21世纪的人类依然是一个现实威胁。更严重的是，近年来，全球人类免疫缺陷病毒(HIV)和艾滋病(AIDS)的流行已成为全球结核病发病率及死亡率第三次回升的主要原因，同时结核病也是AIDS病人最常见的机会感染和致死病因。结核病和艾滋病并发的趋势，使得治疗难上加难。诊断是治疗的前提，如果能够早期诊断，结核病的危害会大幅度减小。中国作为结核菌高感染率地区和HIV感染的快速增长地区，提高结核病及HIV/AIDS合并结核感染的早期准确诊断水平刻不容缓。

传统的早期诊断手段是结核菌素皮试。这是基于迟发型超敏反应原理的一种皮肤试验。但是两个缺陷使得这种诊断方法的意义非常有限。其一：该方法不能区分曾经感染过结核杆菌的健康者与结核杆菌正在活动的发病者；其二：该方法不能区分结核杆菌的感染者与卡介苗的注射者。所以，传统的早期诊断方法只能提供非常有限的参考信息，确诊往往要等到病人出现结核病灶之后。而这时候再做治疗已经晚了，特别是对耐药结核杆菌，病人预后很差。

ELISPOT技术带来了结核病早期诊断的革命。其一，由于ELISPOT方法采用结核分枝杆菌特异性的多肽，可以避免卡介苗注射者的交叉反应；其二，由于ELISPOT检测的是病人当时的细胞免疫水平，可以有效区别健康的TB携菌者与发病的TB活动病人。但是ELISPOT检测步骤繁琐，需要特殊仪器设备且试剂昂贵，在多数低收入的结核高负担国家和地区较难推广。

发展一种快速、灵敏的结核早期诊断方法已迫在眉睫。基于以上背景，本项目选定目前公认的结核分枝杆菌特异抗原蛋白ESAT-6为靶抗原，利用现代生物信息学和分子生物学技术，设计并合成几段候选的ESAT-6特异的抗原肽序列，采用融合杂交瘤技术建立稳定分泌抗结核分枝杆菌特异抗原蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系，并大量制备、纯化和鉴定这些单克隆抗体。该单克隆抗体的成功获得，为建立新型的结核病诊断方法——基于免疫学技术的诊断奠定物质基础。同时对疾病发病机理、诊断、预后及疗效判定等方面的研究起到重要作用。

本发明用到杂交瘤细胞技术。该技术将免疫小鼠的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以建立分泌均质抗体的杂交瘤细胞系，也称为单克隆抗体技术。该技术涉及到动物免疫、细胞培养、细胞融合、细胞克隆培养和免疫测定等一系列方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶蛋白(ESAT-6)的单克隆抗体，具有SEQ No.1的氨基酸序列：Ser Ile His Ser Leu LeuAsp Glu Gly Lys Gln Ser Leu。该单克隆抗体亚型为IgG2b、κ型，命名为杂交瘤细胞株TBEA8，能特异性识别结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶蛋白(ESAT-6)的aa 24-36SIHSLLDEGKQSL抗原肽序列。抗结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶蛋白(ESAT-6)的单克隆抗体杂交瘤细胞已由中国典型培养物保藏中心保藏；地址：中国武汉武汉大学；保藏日期：2010年8月17日；培养物名称、株号和符号(包括基因型)：结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶蛋白(ESAT-6)单克隆抗体杂交瘤细胞TBEA8(IgG2b、κ型)，保藏编号为：CCTCCNO：C201081。

本发明的第二个目的提供抗ESAT-6单克隆抗体的制备方法，通过以下步骤和技术方案实现：

(1)动物的免疫：选择6周龄的BALB/C小鼠，以抗原肽(ESAT-6的第24-36位氨基酸，13肽SIHSLLDEGKQSL)对小鼠进行免疫。13肽SIHSLLDEGKQSL通过固相法合成，在美国ABI公司的多肽合成仪(431A)上进行，采用Fmoc(9-芴甲氧羰基)方案，合成步骤按照ABI公司的多肽合成操作手册进行。经高效液相色谱纯化，纯度＞95％，序列鉴定通过质谱分析。

(2)小鼠骨髓瘤细胞的培养：培养小鼠骨髓瘤细胞SP2/0并使之保持良好的生长状态用于细胞融合。