[发明专利]血清中甘油三酯的两步酶测定方法

说明书

技术领域

本发明属于一种包含酶的测定方法；或是利用可见光，通过测试反应的结果产生颜色变化来测试材料的方法，特别是涉及一种用生化分析仪检测血清中甘油三酯的两步酶测定方法。

背景技术

血清中甘油三脂(TG)的测定方法一般可分为化学法、酶法和色谱法3大类。早期测定方法是以总脂质与胆固醇和磷脂之差估算。化学法用有机溶剂抽提标本中的TG，去除抽提液中磷脂等干扰物后，用碱水解(皂化)TG，以过碘酸氧化甘油生成甲醛，然后用显色反应测甲醛。比较准确的是二氯甲烷-硅酸-变色酸法(Van Handel-Caslson法)，此法抽提完全、能去除磷脂及甘油干扰、变色酸显色灵敏度高、显色稳定，至今还是美国疾病控制与预防中心(CDC)的内部参考方法。但因操作步骤繁多、技术要求高而不适于临床常规检测工作中应用。色谱法包括核素稀释/气相色谱/质谱等方法(ID/GC/MS)，主要用作参考系统中决定性方法的建立及参考物质的制备与定值，此法费用昂贵，样品处理复杂，难以推广应用。另外应用高效液相色谱仪测定血清中的甘油三酯，检测成本高，难以在临床推广。

目前国内几乎所有的临床实验室都用酶法检测血清TG水平，此方法分为一步法和两步法，虽然方法各异，但一般都包括以下几个基本反应步骤：用最合适的脂蛋白脂肪酶(LPL)水解TG生成甘油和脂肪酸；水解后的甘油和三磷酸腺苷(ATP)在甘油激酶(GK)和甘油磷酸氧化酶(GPO)的催化下生成H₂O₂，在过氧化物酶(POD)的催化下，H₂O₂，4-氨基安替比林(4-AAP)和2，4-二氯酚(也有使用4-氯酚、苯酚的衍生物、苯胺盐和苯磺酸盐，下面就以2，4-二氯酚为代表叙述，其他色原不再重复提起，)形成有色染料(常为醌亚胺类)，这些物质的生成量与样本中的甘油三酯含量成正比。最后通过分光光度法计算出相应的TG浓度。具体反应见化学反应式1～4。

生化分析仪检测血清中TG采用的是酶法，一般采用LPL、GPO、POD、4-氨基安替比林和酚等试剂的方法(GPO-PAP法)。其一步法是将LPL、GK、GPO、POD、4-氨基安替比林和2，4-二氯酚、镁盐、表面活性剂及防腐剂等成分溶解在Tris-HCl缓冲液中配制成单一试剂。按中华医学会推荐法配制：Tris-HCl缓冲液每升内含有的主要成分有：Tris 0.15mmol(pH7.6)、2，4-二氯苯酚2.5mmol、MgSO₄10mmol、胆酸钠3.5mmol、Triton X-1000.1g、ATP1.0mmol。GK 500U、GPO 3000U、POD1000U、LPL 3000U、4-氨基安替比林1.2mmol。此法具有简便快速、微量、精密度高的优点，且特异性强，反应线性范围宽，易达到终点。但由于血清中TG水解后产生的甘油以及血清中原有的游离甘油都参与了反应，所以用一步法测定的是血清总甘油酯(定义为TG和游离甘油及少量甘油二酯、甘油一酯之和，习惯统称为TG)，使反应结果不能真实反映血清中TG的含量。中华医学会检验分会于1995年推荐GPO-PAP法的两步酶法作为血清TG常规测定方法。该方法是将原单一的反应试剂分成双试剂，其中LPL和4-氨基安替比林组成试剂Ⅱ，其余成分组成试剂Ⅰ，希望能减少游离甘油的干扰。按中华医学会推荐法配制，其试剂II每升Tris-HCl缓冲液内含有主要成分有：Tris 0.15mmol(pH7.6)、LPL 30000U、4-氨基安替比林1.0mmol。试剂I：每升Tris-HCl缓冲液内含Tris 0.15mmol(pH7.6)、2，4-二氯酚3.0mmol、MgSO₄12mmol、胆酸钠4.2mmol、Triton X-1000.12g、ATP1.2mmol、GK 600U、GPO 3600U、POD 1200U。

国内大部分临床实验室采用一步酶法和两步酶法检测甘油三脂。国内一些试剂厂家生产两步酶法的试剂盒是以GK、GPO、POD、2，4-二氯酚为试剂I，以LPL、4-氨基安替比林作为试剂Ⅱ。也有的厂家以GK、GPO、2，4-二氯酚为试剂I，以LPL、4-氨基安替比林和POD作为试剂Ⅱ。这些试剂盒既可以作为双试剂使用，也可以将两种试剂合在一起作为单试剂使用。中华医学会推荐的两步酶方法可以消除脂血、溶血、黄疽的干扰等优点，但在实际应用中也存在以下问题：