[发明专利]一种高效液相色谱－荧光法同时测定血清色氨酸和酪氨酸的方法

说明书

技术领域

本发明属于分析化学领域，涉及一种高效液相色谱-荧光法同时测定血清色氨酸和酪氨酸的方法。

背景技术

目前国内外报道的检测Tyr和Trp的方法较多，包括高效液相色谱法(HPLC)、高效毛细管电泳法(HPCE)、质谱法(MS)等。HPCE分析时间较短，分离能力较强，但检测限(紫外吸收检测器)不及HPLC，且重复性较差；质谱技术亦有操作复杂、重复性较差的不足之处；相对来说，HPLC应用较广泛。色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)具有吲哚结构，自身能产生荧光，故可采用荧光法检测。国内外已有采用HPLC-荧光法(HPLC-FD)或HPLC-紫外法(HPLC-UV)分别单独检测血清中Tyr和Trp的报道，有采用HPLC-UV同时测定Tyr和Trp的报道，也有采用高效液相色谱法测定脑脊液中Tyr和Trp含量的报道，但目前尚未有采用HPLC-FD同时测定血清中的Tyr和Trp的报道。近来，Sanchez-Machado等用HPLC-FD同时测定虾废料中的Tyr和Trp含量，但是线性范围窄，虽能满足虾废料中氨基酸的检测需要，但不能满足临床血清样本的检测要求。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效液相色谱-荧光法同时测定血清色氨酸和酪氨酸的方法，本发明分析时间短，试剂消耗少，灵敏度高，特异性好，能满足临床血清样本的检测要求。

本发明可以通过以下技术方案实现。

本发明采用的检测仪器是：510色谱泵、2475型荧光检测器(Waters公司)、HS2000色谱数据工作站(杭州英谱科技开发有限公司)、Rheodyne 7725手动进样器(带20μL进样环)。0.22μm滤膜及其抽滤器(Millipore公司)；Milli-Q纯水器(Millipore公司)；TGLL 218台式高速冷冻离心机(湖南湘仪离心机厂)；SB2200型超声去气仪(上海必信能有限公司)。

本发明的主要试剂有：Tyr、Trp、5-羟色胺(5-HT)、犬尿喹啉酸(Kyna)、苯丙氨酸(Phe)、犬尿氨酸(Kyn)和肌酐(Cr)均购自Sigma公司；乙腈、甲醇均为色谱纯，购自美国Tedia公司；醋酸锌、冰醋酸等均为国产分析纯，高氯酸为国产优级纯。

本发明采用的检测条件是：其中色谱柱：Megres C18柱(250mm×4.6mm i.d.，5μm，江苏汉邦科技有限公司)；流动相：10％(v/v)乙腈；流速：1.2mL/min；荧光检测波长：0-5min激发光波长228nm，发射光波长为306nm；5min后激发光波长285nm，发射光波长为353nm；进样量：20μl；室温下测定。

本发明的检测原理：色氨酸和酪氨酸可以产生自然荧光，利用荧光检测器可调波长的性质选择色氨酸和酪酸的最佳检测波长，在最佳色谱条件下使色氨酸和酪氨酸分离，色谱分离后的两种氨基酸经过荧光检测器和色谱数据工作站的检测和处理，作出色谱图，然后根据色谱图完成氨基酸的含量分析和测定。

本发明包括以下步骤：

a、采用Megres C18柱250mm×4.6mm i.d.，5μm色谱柱；

b、流动相的组成：10％(v/v)乙腈；

c、流速为1.2ml/min，进样量：20μl，室温下测定；

d、利用荧光检测器扫描确定色氨酸和酪氨酸的最大激发光波长和发射光波长，进而使得两种物质均在其最佳波长下得到检测。可调波长设定为：0-5min激发光波长228nm，发射光波长为306nm；5min后激发光波长285nm，发射光波长为353nm；

e、对建立方法进行方法学评价：混合标准品和血清样品的检测、标准曲线和检测限、精密度的评价、回收率的考察和干扰试验。

与现有技术相比，本发明具有的优点和效果如下：

1、本发明首次成功建立了一种HPLC-FD同时测定人血清中Tyr和Trp的方法。Tyr和Trp具有自然荧光，本发明利用荧光检测器自动转换激发光与发射光波长的优势，选择Trp和Tyr的最佳波长，使Trp和Tyr的色谱峰峰面积最大，检测灵敏度增加；与已报道方法比较，本发明分析时间短，试剂消耗少，灵敏度高，特异性好，能满足临床血清样本的检测要求。

2、本发明原理简单、操作简便、快速(9min可完成检测)、可行性高。