[发明专利]具有反应原性的分泌蛋白和其编码核酸及引物对

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域的蛋白和其编码核酸及引物对，具体是一种具有反应原性的分泌蛋白和其编码核酸及引物对。

背景技术

牛结核病主要是由牛分支杆菌(Mycobacterium bovis，MTB)引起的一种人兽共患传染病，它严重危害人类的健康和畜牧业的发展并且导致很大的经济损失。牛分支杆菌有很广的动物宿主谱，也给该病的控制带来很大的困难。现今，牛结核病的防制主要是采用牛结核菌素PPD进行变态反应诊断，然后对诊断出的阳性牛进行隔离或捕杀，以达到消灭该病的目的。但是，应用该防制措施并未达到控制该病的目的，反而近年来呈上升趋势。目前国际上广泛应用的仍然是PPD皮试反应检测法，但其效果不理想，检测过程中假阳性的比率很高。因此，开发新型、高效的检测方法已成为控制牛结核病的研究热点。

近年来，人们对结核杆菌培养滤液中的分泌蛋白进行了广泛的研究，发现分泌蛋白大多具有免疫反应原性，在结核病患者体内也可诱导抗体的产生。因此利用分泌蛋白作为抗原，用于检测患者血清中分支杆菌抗体，从而对其分支杆菌感染状态进行检测，是近年来的重要发展方向。Rosenkrands等运用双向电泳对结核杆菌蛋白质组进行分析，发现Mb2277存在于培养滤液中，证明该蛋白也是一种分泌蛋白。因为结核杆菌基因组与牛分支杆菌中的基因组有99％以上的同源性，在结核杆菌中发现的分泌蛋白，极有可能在分支杆菌中存在。

经对现有技术的文献检索发现，尚未见与本发明的具有反应原性的分泌蛋白、其编码核酸及引物对的有关的报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种具有反应原性的分泌蛋白和其编码核酸及引物对。本发明得到一种具有反应原性的分泌蛋白，利用本发明的分泌蛋白可用来检测牛血清中分支杆菌抗体，为实现高通量的牛结核病检测技术奠定了基础。

本发明是通过以下的技术方案实现的，

本发明涉及一种具有反应原性的分泌蛋白，该蛋白是由碱基序列如SEQ ID NO：1所示的核酸编码的。

本发明还涉及一种具有反应原性的分泌蛋白的编码核酸，该核酸的碱基序列如SEQ IDNO：1所示。

本发明还涉及一种扩增具有反应原性的分泌蛋白编码核酸的引物对，上游引物的碱基序列如SEQ ID NO：2所示，下游引物的碱基序列如SEQ ID NO：3所示。

本发明根据GenBank提供的结核杆菌Mb2277基因序列(Genebank登录号为：AF2122/97)，采用引物设计软件Primer Premier 5.0设计2对引物，在上、下游引物的5’和3’端分别加上BamH I和HindIII酶切位点；以牛分支杆菌染色体DNA为模板，进行PCR扩增，经克隆、序列分析和双酶切鉴定，获得了M.bovis Mb2277原核表达菌株，IPTG诱导表达，表达的蛋白质N_末端融合有6个组氨酸的多肽标签。利用牛分支杆菌阳性血清对其进行Westernblotting检测，结果为阳性，表明Mb2277表达的蛋白存在于培养滤液中，并具有牛分支杆菌的免疫原性。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：本发明得到一种具有反应原性的分泌蛋白，利用本发明的分泌蛋白可用来检测牛血清中分支杆菌抗体，为实现高通量的牛结核病检测技术奠定了基础。

本发明中所涉及的菌株大肠杆菌DH5α、大肠杆菌BL21(DE3)已在(汪玲玲，杨辑，黄诚之，王海洪；大肠杆菌holo-ACP的过表达、分离纯化及长链脂酰ACP的合成，微生物学报，2008，48(7)：963～969)文献中公开。本发明涉及的菌株可通过公开市售的商业渠道取得，如上海天根生物公司，公司地址：上海市漕溪路258弄27号航星商务楼1号楼606室。

附图说明

图1MB2277基因扩增PCR电泳结果；

图2重组质粒经双酶切后产物的电泳结果；

图3为各时刻取样的SDS-PAGE电泳结果图；

图4Western blotting结果图。

具体实施方式

以下实例将结合附图对本发明作进一步说明。本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

步骤一，DNA的提取