[发明专利]基于毛细管凝胶电泳检测的微滴聚合酶链式反应分析方法

权利要求书

1.一种基于毛细管凝胶电泳检测的微滴聚合酶链式反应分析方法，其特征在于，包括如下步骤：

第一步：多重模板的合成：将含有不同目标DNA分子的纯化DNA模板通过一个或几个常规复合PCR应用目标特异性引物进行预扩增，产生含有通用序列尾巴的多重模板；

第二步：通用微滴PCR扩增：在通用微滴PCR中，使用一对与通用序列尾巴互补的通用引物在水油乳化剂中对纯化的复合PCR预扩产物进行微滴PCR扩增；

第三步：毛细管凝胶电泳分析：根据目标序列的大小不同，应用毛细管凝胶电泳对纯化的微滴PCR扩增产物进行自动分离检测。

2.根据权利要求1所述的基于毛细管凝胶电泳检测的微滴聚合酶链式反应分析方法，其特征是，所述的纯化DNA模板是指应用DNA提取试剂盒，从原材料中分离纯化的获得的用于PCR扩增的基因组DNA。

3.根据权利要求1所述的基于毛细管凝胶电泳检测的微滴聚合酶链式反应分析方法，其特征是，所述的目标特异性引物是指长度为43±6Nt的寡核苷酸链，由5’端的通用序列尾巴和3’端目标特异性互补序列组成，其3’端的目标特异性序列部分与目标基因序列完全互补或者相同，5’端的通用尾巴序列部分与通用引物序列相同。

4.根据权利要求3所述的基于毛细管凝胶电泳检测的微滴聚合酶链式反应分析方法，其特征是，所述的通用引物是指长度为20Nt的寡核苷酸链，正、反向通用引物分别与目标特异性引物的的5’端相同。

5.根据权利要求1所述的基于毛细管凝胶电泳检测的微滴聚合酶链式反应分析方法，其特征是，所述的多重模板是指，通过复合PCR预扩增所产生的不同PCR产物的混合模板，其产物的两端分别含有一段来自目标特异性引物的通用序列尾巴。

6.根据权利要求1所述的基于毛细管凝胶电泳检测的微滴聚合酶链式反应分析方法，其特征是，所述的微滴是指，25摄氏度条件下，取1体积份的PCR反应混合液在1.5分钟内逐滴加入到2体积份的油-表面活性剂混合物中，同时利用涡旋混合器进行混匀得到水油乳化剂，该水油乳化剂中微滴的直径在1～8μM，每微升的水油乳化剂中包含3×10⁶到1×10⁷个微滴。

7.根据权利要求1或6所述的基于毛细管凝胶电泳检测的微滴聚合酶链式反应分析方法，其特征是，所述的水油乳化剂的组分及其含量为：1体积份的水相和2体积份的油相，其中的水相的组分为：1×KOD-Plus-反应缓冲液、10g/L BSA、1.5mM MgSO₄、200μM dNTP、400nM引物Uni-F/R、5.2U KOD-Plus-DNA聚合酶、以及适量模板DNA分子；油相组分为：Span804.5％(v/v)、Tween 80 0.4％(v/v)、Triton X-100 0.05％(v/v)、矿物油95.05％(v/v)。

8.根据权利要求1所述的基于毛细管凝胶电泳检测的微滴聚合酶链式反应分析方法，其特征是，所述的PCR产物纯化是指应用PCR产物纯化试剂盒纯化复合PCR预扩增产物。

9.根据权利要求1所述的基于毛细管凝胶电泳检测的微滴聚合酶链式反应分析方法，其特征是，所述的纯化是指微滴PCR完成后，收集相同反应的水油乳化剂16000g，并在室温环境下离心处理5分钟后取下层包含微滴PCR扩增产物的水相，并用PCR产物纯化试剂盒纯化该水相。