[发明专利]一种超声辅助农杆菌介导的植物in planta遗传转化方法

权利要求书

1.一种超声辅助农杆菌介导的植物in planta遗传转化方法，其步骤是：

A、农杆菌培养及转化前处理 ：

将农杆菌菌株接种于LB培养基，28℃，摇床培养1～2d后，再转接新鲜的LB培养液中，摇菌22-26 h，使OD₆₀₀在1.8～2.0，6000rpm 离心收集菌体10～15 min，室温为20-25℃，2倍体积转化培养基溶解；

B、超声辅助农杆菌介导的in planta遗传转化：

选择待处理的植株，去除所有已开放的花朵，将所有植株的主花序用转化培养基溶解的农杆菌菌液进行2～30 sec不同时间倒置超声侵染处理，同时挂牌标明处理时间，侵染完后倒置油菜，将其处理部位用保鲜膜套住，阴处平放22-26h后，除去保鲜膜，蒸馏水冲洗植株后，于土壤钵中置正常生长条件下培养，待成熟期收获T1代种子；

所述的待处理植株为刚开放1-2朵花花蕾期的植株；

所述的超声辅助农杆菌介导的植物in planta高效遗传转化的对象为未开花的花蕾；

所述的超声波处理的参数为：电源220V 50Hz超声频率为28/45 KHz，超声电功率为500W；

所述的超声处理时间为2 sec，5 sec，15 sec，30sec 4个处理，分别以未经超声直接侵染处理的植株为各自对照：2 sec ck，5 sec ck，15 sec ck，30 sec ck；

C、卡那霉素抗性筛选：将收集到的部分T1代种子进行卡那霉素抗性植株筛选，所述的卡那霉素抗性筛选浓度为350 mg/L；

D、PCR检测抗性植株中的gus基因：将筛选到的抗性植株进行PCR快速检测，所述的PCR检测抗性植株中的gus基因所用到的引物是：

GusF2：CGGCAAAGTGTGGGTCAAT   5’to 3’

GusR2：AAGGGTAATGCGAGGTACGGT  5’to 3’ 

Gus基因扩增片段长度为500bp。

2.根据权利要求1所述的一种超声辅助农杆菌介导的植物in planta遗传转化方法，其特征在于：所述的农杆菌菌种为EHA105-gus-2301；转化培养基为：MS基本培养基+6-BAP+ 5% 蔗糖+Silwet-77，pH=5.8。

3.根据权利要求1所述的一种超声辅助农杆菌介导的植物in planta遗传转化方法，其特征在于：所述的待处理植株为甘蓝型油菜浙油18，拟南芥,白菜型油菜0639,3965，芥菜型油菜2522,2565，野芥野油41。