[发明专利]一种制备β-甘露聚糖酶的方法及专用菌株

权利要求书

1.一种重组菌，是将β-甘露聚糖酶的编码基因导入出发菌株，得到的重组菌；所述β-甘露聚糖酶的编码基因序列如SEQ ID NO：1中第7-1407位核苷酸所示。

2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于：所述β-甘露聚糖酶的编码基因是通过重组载体导入出发菌株的；所述重组载体为如下(1)或(2)或(3)所示：

(1)将SEQ ID NO：1所示DNA片段插入pAO815alpha的XhoI和EcoRI酶切位点间，得到的重组载体，记作pAOα-1sman；其中，XhoI酶切位点位于SEQ ID NO：1所示DNA片段的5′端上游，EcoRI酶切位点位于SEQ ID NO：1所示DNA片段的3′端下游；

(2)用BamHI/BglII双酶切pAOα-1sman，回收2932bp片段；用BamHI单酶切pAOα-1sman，回收载体大片段；将所述2932bp片段和所述载体大片段连接，得到的重组载体，记作pAOα-2sman；

(3)用BamHI/BglII双酶切pAOα-2sman，回收5864bp片段；用BamHI单酶切pAOα-2sman，回收载体大片段；将所述5864bp片段和所述载体大片段连接，得到的重组载体，记作pAOα-4sman；

所述pAO815alpha按照如下方法得到：将载体pPICZα用SacI/EcoRI双酶切，收集1000bp片段；用SacI/EcoRI双酶切载体pAO815，回收载体大片段；将所述1000bp片段和所述载体大片段连接，得到的重组载体即为pAO815alpha；

所述出发菌株为酵母菌，优选为毕赤酵母菌，再优选为巴斯德毕赤酵母菌株GSl15。

3.根据权利要求1或2所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌为巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS4SMAN，其保藏编号为CGMCC NO.4095。

4.一种制备β-甘露聚糖酶的方法，包括如下步骤：将权利要求1-3中任一所述重组菌接种于发酵培养基中，发酵培养，得到β-甘露聚糖酶；将发酵容器内的所有物质记作发酵体系。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述发酵培养基为用于培养毕赤酵母菌的培养基，且其中含有甘油；

所述发酵培养依次按照如下三个阶段进行：

阶段一：包括如下步骤：从接种开始培养至发酵体系中的甘油耗尽；

阶段二：包括如下步骤：在发酵体系中的甘油耗尽时，开始流加甘油或甘油溶液，培养至发酵体系的OD₆₀₀值达到200-350或200或250或320或350，停止流加甘油或甘油溶液；

阶段三：为如下1)或2)所示：

1)包括如下步骤：在发酵体系中的甘油耗尽时，向发酵体系中加入山梨醇与甲醇的混合水溶液或甲醇或甲醇溶液，进行诱导表达；

2)包括如下步骤：在发酵体系中的甘油耗尽时，将发酵体系的温度调至26℃～29℃或26℃或27℃或28℃或29℃，向发酵体系中加入山梨醇与甲醇的混合水溶液或甲醇或甲醇溶液，进行诱导表达；

所述甘油溶液由甘油、PTM₁溶液和水组成；所述甲醇溶液由甲醇、PTM₁溶液和水组成。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述山梨醇与甲醇的混合水溶液中，山梨醇与甲醇的质量比为1∶20～1∶5或1∶20或1∶10或1∶5。

7.根据权利要求4-6中任一所述的方法，其特征在于：所述山梨醇与甲醇的混合水溶液中，山梨醇的浓度为36g/L-144g/L或36g/L或72g/L或144g/L，甲醇的浓度为720g/L。

8.根据权利要求4-7中任一所述的方法，其特征在于：所述阶段一和所述阶段二中的培养在pH值为6.0、温度为30℃、溶氧为30％以上的条件下进行；

所述阶段三中的1)中，诱导表达在pH值为6.0、温度为30℃、溶氧为30％以上的条件下进行；

所述阶段三中的2)中，诱导表达在pH值为6.0、温度为26℃～29℃或26℃或27℃或28℃或29℃、溶氧为30％以上的条件下进行。