[发明专利]一种采用PCR特异检测片形吸虫的试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物检测领域，尤其涉及一种试剂盒，特别涉及肝片吸虫、大片吸虫、中间型吸虫成虫、尾蚴、虫卵的特异PCR检测，具体来说是一种采用PCR特异检测片形吸虫的试剂盒。

背景技术

片形吸虫病是由片形科(Fasciolidae)片形属(Fasciola)吸虫(肝片吸虫、大片吸虫、中间型吸虫)寄生于家畜肝脏、胆管而引起的一种蠕虫病。主要发生于反刍动物(黄牛、水牛、绵羊、山羊、骆驼等)，协诊症状主要是营养障碍和中毒所引起的慢性消瘦和衰竭；病理特征是慢性胆管炎及肝炎。人也可以感染片形吸虫。本病病原主要为肝片形吸虫和大片形吸虫两种，目前在越南还发现中间型吸虫感染动物和人的报道。三种吸虫成虫形态基本相似，虫体扁平，呈柳叶状。肝片吸虫长20-35毫米，宽5-13毫米，色红褐，呈扁平的叶片状，虫体肩部宽而明显；大片吸虫长33-76毫米，宽5-12毫米，肩部不明显，后端钝圆。中间吸虫的形态很难有确定的描述，某些中间型吸虫的形态近似肝片吸虫，某些中间型吸虫的形态又近似大片吸虫，所以，在中间型吸虫的分类定位方面，传统的形态学较难区分中间型吸虫。

近年来，以聚合酶链反应(PCR)为基础的分子生物学方法已在寄生虫学领域广泛应用。PCR以其简便、快速、特异、敏感等优势已在人及动物寄生虫病的诊断中应用，片形吸虫病的诊断方法主要是通过形态学检测成虫和感染动物排出的虫卵。建立片形吸虫特异PCR诊断方法的关键是寻找敏感、特异的遗传标记。

综上所述，现有检测方法存在检出率不高、假阳性较多、费时费力，容易出现误诊和漏诊，敏感性有限等问题，迫切需要探讨一种使用方便、灵敏度高，且适合用于尾蚴和虫卵的快速检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种采用PCR特异检测片形吸虫的试剂盒，所述的这种采用PCR特异检测片形吸虫的试剂盒要解决现有技术中检测片形吸虫的方法检出率不高、假阳性较多、费时费力，容易出现误诊和漏诊，敏感性有限的技术问题。

本发明提供了一种采用特异PCR检测片形吸虫的试剂盒，含有DNA裂解液、PCR反应液和肝片吸虫、大片吸虫、中间型吸虫DNA阳性对照液，所述的DNA裂解液中由细胞裂解液、EDTA、蛋白酶K和RNase A溶液配制而成，在所述的DNA裂解液中，所述的细胞裂解液的终浓度为7-10μM，所述的EDTA在所述的DNA裂解液中的终浓度为0.5M，所述的蛋白酶K在所述的DNA裂解液中的终浓度为18-20mM，所述的RNase A在所述的DNA裂解液中的终浓度为3-5uM，所述的PCR反应液中由dATP、dTTP、dGTP、dCTP、扩增肝片吸虫的下游引物、扩增大片吸虫的下游引物、扩增肝片吸虫和大片吸虫的共用上游引物与MgCl₂配制而成，所述的扩增肝片吸虫的下游引物的序列为5‘-CCAATGACAAAGTGACAGCG-3’，所述的扩增大片吸虫的下游引物为5‘-CCAATGACAAAGTAACAGCA-3’，扩增肝片吸虫和大片吸虫的共用上游引物的序列为5‘-ATATTGCGGCCATGGGTTAG-3’，在所述的PCR反应液中，所述的dATP、dTTP、dGTP和dCTP的终浓度均为200μM，所述的扩增肝片吸虫的下游引物、扩增大片吸虫的下游引物和扩增肝片吸虫和大片吸虫的共用上游引物的终浓度均为50pmol/μL，所述的MgCl₂的终浓度为2mM。

进一步的，所述的试剂盒中还含有Taq DNA聚合酶。

进一步的，所述的肝片吸虫、大片吸虫和中间型吸虫DNA阳性对照液的浓度均为33.0-42ng/μl。

进一步的，所述的Taq DNA聚合酶的浓度为6U/μL。

进一步的，所述的Taq DNA聚合酶的体积为25μL。

本发明还提供了一种采用特异PCR方法检测片型吸虫的方法，包括如下步骤：

(1)对未知吸虫的成虫、尾蚴、虫卵进行DNA的提取；

(2)以上述提取的DNA作为模板，利用PCR反应液进行扩增，所述的PCR反应液中由dATP、dTTP、dGTP、dCTP、扩增肝片吸虫的下游引物、扩增大片吸虫的下游引物、扩增肝片吸虫和大片吸虫的共用上游引物与MgCl₂配制而成，所述的扩增肝片吸虫的下游引物的序列为5‘-CCAATGACAAAGTGACAGCG-3’，所述的扩增大片吸虫的下游引物为5‘-CCAATGACAAAGTAACAGCA-3’，扩增肝片吸虫和大片吸虫的共用上游引物的序列为5‘-ATATTGCGGCCATGGGTTAG-3’；