[发明专利]弥漫性大B细胞淋巴瘤分子病理分型方法及试剂盒和应用

说明书

技术领域

本发明涉及血液肿瘤学和医学领域，尤其涉及弥漫性大B细胞淋巴瘤分子病理分型方法及试剂盒和应用。

背景技术

弥漫性大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)是最常见的非霍奇金淋巴瘤，约占每年初发非霍奇金淋巴瘤的40％左右。我国目前非霍奇金淋巴瘤的发病率约为3-4/10万，并以每年2-3％的速度增长，其中弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)最为常见，约占每年所有淋巴瘤的50％，因此，每年全国新发病例约为2-3万。

DLBCL具有显著的生物学异质性，病人对治疗的反应差异显著，常规的CHOP联合化疗方案(环磷酰氨、阿霉素、长春新碱和泼泥松)只能使约40％的患者获得长期缓解。随着人-鼠嵌合性抗CD20单克隆抗体(利妥昔单抗，Rituximab)联合化疗(R-CHOP)的应用，进一步提高DLBCL的临床疗效，但仍有30-40％的患者对治疗无效或治疗后迅速复发，疾病进展快，预后差。因此，加强DLBCL生物学特性的研究，制定相应的治疗方案成为目前DLBCL的研究热点。当前临床对DLBCL进行危险分层，主要是通过国际预后指数(International Prognostic Index，IPI)，包括：年龄，体力状态，临床Ann Arbor分期，节外病灶数目，乳酸脱氢酶水平。由于这种评价只是临床参数的组合，不能反映肿瘤发生过程中内在的分子生物学异质性，因此对于相当一部分病例的预后不能进行准确评价，一些被分在低危、低中危组的病人5年生存率仍仅有32％。

基因芯片技术的应用为阐明DLBCL潜在的生物学异质性提供了一个高通量平台，通过DLBCL基因表达谱分析，鉴别出了三种DLBCL亚型，提示肿瘤性B细胞处在不同的分化阶段：一种称为生发中心B细胞样DLBCL(germinal center B cell-like DLBCL，GCB)，此亚型因与正常生发中心B细胞表达的基因标志相同而得名；另一种亚型称为活化B细胞样DLBCL(activated B cell-like DLBCL，ABC)，此亚型表达的基因型与促有丝分裂刺激后外周血B细胞相似，GCB与ABC之间有数千基因表达差异。除以上两型之外，仍有17％-40％的DLBCL无法用细胞起源来分型，被统称为3型(type3)，ABC和type3统称为非GCB(non-GCB)。DLBCL亚型是独立于IPI的预后评价指标，各亚型对传统的联合化疗CHOP方案的反应性和疗效各不相同，ABC和GCB的五年生存率分别为31％和59％，GCB的生存率明显好于ABC，而3型本身具有异质性，无确定的生存率，但其总体预后情况与ABC亚型相似。

通过20例弥漫大B细胞淋巴瘤基因芯片表达谱分析，检测到一些与弥漫大B细胞淋巴瘤分子病理分型及预后相关的特定基因，如：Bcl-2，Bcl-6，CCND2，MYC，SCYA3，FN1，FOXP1，PKC-β，HGAL，CD10，和MUM1等等。从中筛选出三个代表着B细胞分化不同阶段的基因：CD10，Bcl-6和MUM1，其中CD10和Bcl-6为生发中心B细胞标志，而MUM1为后生发中心B细胞标志。

基因芯片技术加深了对DLBCL生物学特性的理解，但因其对标本的要求较高(新鲜标本、适宜的冷冻保存等)、操作复杂、且基因芯片检测代价较高，故制约了其临床实用性。申请号为200710173600.8的发明专利申请是利用普通免疫组织化学(immunohistochemistry，IHC)的方法，对DLBCL标本进行CD10、Bcl-6和MUM1蛋白的表达情况检测，并通过结果分析对弥漫大B细胞淋巴瘤进行分子病理分型。但是，这种常规免疫组化的方法基本上是通过显色的手段来进行结果判断，三种指标的检测就意味着同一个样本最少需要三张切片，每张切片进行一次免疫组化实验，然后对三张切片的结果分别进行判读。整个过程存在很多重复步骤，操作繁琐、效率低。

发明内容

本发明要解决普通免疫组化方法对弥漫性大B细胞淋巴瘤进行分子病理分型时操作繁琐、效率低的技术问题，提供一种结合量子点技术的弥漫性大B细胞淋巴瘤分子病理分型方法，显著提高了实验的工作效率。

此外，还需要提供一种弥漫性大B细胞淋巴瘤分子病理分型的试剂盒及其应用。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：

在本发明的一个方面，提供了一种弥漫性大B细胞淋巴瘤分子病理分型方法，包括以下步骤：

将三种不同波长的量子点标记物作为荧光探针，检测生物样品中CD10、Bcl-6和MUM1蛋白的表达；