[发明专利]小花棘豆中产苦马豆素内生真菌的分离方法

说明书

技术领域

本专利属于生物制药领域，具体涉及小花棘豆中产苦马豆素内生真菌的分离方法及所得产苦马豆素菌株。 

背景技术

苦马豆素属多羟基吲哚里西啶类生物碱，是一种极强的α-甘露糖苷酶竞争性抑制剂，导致糖蛋白合成异常及部分合成的低聚糖在溶酶体内聚积，引起细胞空泡变性，造成器官组织损害和功能障碍而中毒。但苦马豆素有增强机体免疫功能、抗病毒、抗癌抗肿瘤、抗菌等药理作用。值得一提的是，苦马豆素的抗肿瘤活性已经是近年来肿瘤后备药物筛选的热点。然而制约国内苦马豆素抗肿瘤药物研发进程的主要问题是苦马豆素来源十分困难，远远不能满足人们研究的需要。 

内生菌是指在其生活史中的某一段时期生活在植物组织内，对植物组织没有引起明显病害症状的微生物。内生菌与寄主之间为互利共生关系，一方面内生菌为植物生长提供养料，促进植物生长，另一方面使得宿主植物对环境表现适应性，对环境胁迫表现出一定的抗性(如抗干旱、抗病虫害等)，有的还对食草动物表现出毒性，以维持其生存的需要。 

目前苦马豆素的来源有三种途径，第一种是从豆科黄芪属、棘豆属植物和苦马豆属植物，以及旋花科番薯属、锦葵科黄花稔属植物中提取。由于植物本身含苦马豆素的量很低，提取率低，产量有限，难以满足需求；第二种是通过人工合成途径得到，合成产物存在同分异构和手性结构现象，使得分离很困难，产率低，并不适宜大规模的工业化生产；第三种方法是从真菌菌丝体或发酵液中提取即生物合成。 

在目前获取苦马豆素的三种途径中，人工合成途径是人们研究的重点。自美国化学家Yasuda(1984)、Bennett(1989)等先后报道人工合成苦马豆素以来，人们采用了不同的方法合成苦马豆素，可分为以下四种：①Mootoo(2001)的合 成方法，关键步骤是使用氨水使二乙醛酮(keto-bisaldehyde)的氨基化降低了3倍，以保证目标物质只有一种对映异构体。该法以2，3，5，6-二-O-甘露呋喃糖(2，3：5，6-di-O-mannofuranose)为起始物，共需13步，产率为15％。②Trost(1999)和Katsuki(2000)报道的不对称合成法，以二元醇为起始物，分别需要17步和11步，产率为13％和10％。③Pearson(2002)报道的改进后的方法。以异抗坏血酸(D-isoascorbic acid)为起点，共需10步，产率为12％。④Blechert(2002)，Carretero(2000)，Pyne(2002)等报道的以吲哚里西啶顺二羟基亮氨酸(syn-dihydroxylation)衍生物开始，分别需要15步，18步和16步，产率分别为38％(以内消旋二元醇开始计算)，6.5％和4.5％。中国科学院院士周维善等(1993)人工合成苦马豆素也获成功，但产率很低。从植物(主要是疯草)中分离是目前提取苦马豆素所常用的方法，但这种方法有很大的局限性，对草原植被造成破坏，且疯草中苦马豆素含量较低，不能作为大规模提取苦马豆素的方法。 

前两种方法(从植物中提取和化学合成)，由于产量低，不能满足人们对苦马豆素抗肿瘤活性研究及其产品开发的需要。因此，探索通过产量高、提取成本低且对环境没有危害的微生物发酵途径获取苦马豆素，就成为目前人们关注的热点。这就是第三种方法：从真菌菌丝体或发酵液中提取即生物合成。关于苦马豆素的生物合成，目前国内已经申请的专利有6项即“生物发酵提纯苦马豆素的工艺”(02114591.1)、“绿僵菌发酵提纯苦马豆素的工艺”(200610043120.5)、“白僵菌发酵生产苦马豆素的工艺”(200710199249.X)、“一种合成苦马豆素的棘豆埃里格孢菌及其制备方法和应用”(200910021082.7)、“一种合成苦马豆素的棘豆埃里格孢菌FEL5-AS1和应用”(200910021858.5)、“一种合成苦马豆素的棘豆埃里格孢菌FEL6-AS2及其应用”(200910021861.7)，其存在的不足和缺陷是： 

①“生物发酵提纯苦马豆素的工艺”：是由杨凌大农生物技术有限公司申请，中国专利公开号CN1396263，公开日2003年2月12日，发明创造的名称为“生 物发酵提纯苦马豆素的工艺”，其所采用的微生物菌株是自行从自然界豆科植物中分离、筛选的可产生苦马豆素的豆类丝核菌7-3菌株(代号)。其存在的不足和缺陷是，在专利中没有公开豆类丝核菌7-3菌株的具体获得方法和途径，也没有公开该豆类丝核菌7-3菌株的具体生物学特性、标准、以及品质鉴定方法。这样使得同领域的普通技术人员无法按说明书的内容重复实现。