[发明专利]一种适配体功能化磁性纳米材料磁分离-上转换荧光纳米材料标记检测赭曲霉毒素A的方法

说明书

技术领域

本发明涉及利用磁性纳米材料和上转换荧光纳米材料结合核酸适配体识别对赭曲霉毒素A进行检测，特点在于利用赭曲霉毒素A适配体功能化的磁性纳米材料对大宗样品中赭曲霉毒素A分离富集，使得检测周期缩短并使得检测灵敏度提高，同时利用上转换荧光纳米材料作为标记物通过检测激光诱导上转换荧光信号进一步提高检测的灵敏度，该方法属于纳米材料与分子生物技术领域。 

背景技术

赭曲霉毒素A(ochratoxinA，OTA)是曲霉菌属和青霉菌属的某些种产生的空间代谢产物，毒理学研究表明，OTA具有肾脏毒性、肝脏毒性、免疫毒性，以及致畸、致癌和致突变作用等多种毒性，对动物和人体健康有很大的潜在危害。OTA在自然界分布广泛，主要存在于谷类、豆类及豆制品、干果、咖啡、葡萄及葡萄酒、香科、汕料作物、啤酒、茶叶等中。因此，建立准确、灵敏、快速的OTA检测技术对于食品安全具行重要意义。 

目前已建立的OTA检测方法主要包括薄层层析法、高压液相色谱—质谱联用、酶联免疫吸附法(ELISA)、胶体金免疫层析分析法(GICA)等。现场快速筛检方法中则以ELISA和GICA方法应用最多，这两种方法均是基于抗原—抗体亲和反应，以抗体作为识别分子。但抗体易受外界条件尤其是温度的影响，对保藏条件要求苛刻，在很大程度上限制了方法的灵活应用。此外，抗体制备需要经过动物实验或细胞实验，繁琐费时，制备的抗体成本高，发展的方法检测成本也相应偏高。所以有必要发展一种快速方便，稳定性好、灵敏度高、特异性强、使用成本低的新型检测方法。 

核酸适配体(aptamer)是从体外合成的随机寡核苷酸文库中通过指数富集配体的系统进化(systematiccvolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)技术筛选得到的与靶物质特异性结合的一簇DNA或RNA片段。这种寡核苷酸序列形成的高级结构具有能识别与之相对应的任何类型的蛋白和低分子的靶物质，并与靶物质有高亲和力而形成靶物质—适配子的复合物。与抗体相比，核酸适配体具有易合成、易修饰、易固定、可反复使用和长期保存的优点，并且核酸适配体作为识别分子在蛋白质研究、药物检测、医学诊断和食品安全等方面得到了广泛应用。 

另一方面，近年来纳米材料与分子生物技术两者之间的关系越米越紧密，新型纳米材料在分析检测中 的发展前景也越来越广阔。其中上传换纳米荧光纳米材料和磁性纳米材料具备独特的功能被所人们关注。 

在稀土掺杂的无机纳米材料中一类特殊的发光材料，它能够通过多光子机制把长波辐射(近红外光)转换成短波辐射，发射出比激发光波长短的荧光(紫外可见光)，即上转换荧光。它是一种反Stokes发光，已成为把红外光转换成可见光的有效方法。上转换材料具有如下诸多优点：光化学稳定，检测背景低，穿透性强，且可以通过选择不同的基质材料和掺杂离子来调节上转换发光，不同稀土离子掺杂的纳米粒子发射不同的上转换荧光，真正实现单激发多发射，从而有利于生物体系中多组分同时检测。鉴于上述优点，上转换纳米材料已成为一种优秀的生物标记材料。同时在实际生物样品的检测中，由于被测样品很少，标记与检测中的分离步骤复杂，如何有效地进行标记与未标记样品的分离以及对痕量样品的富集，将直接影响检测的灵敏度和准确性。由于磁性纳米颗粒性能稳定，较易制备，且与多种分子复合可使粒子表面功能化。利用磁性纳米材料和上转换纳米擦了可快速有效地将目标物质分离与富集，具有特异性高、分离快、重现性好等优点，可有效提高分析检测的灵敏度和准确性。 

本发明首先合成得到了表面生物功能化的磁性纳米材料和上转换纳米材料，再通过磁性纳米材料结合的核酸适配体和上转换纳米材料结合的核酸适配体互补链之间的DNA杂交将两者组装构成复合纳米结构，以980nm激光激发诱导上转换荧光为检测信号，通过对不同浓度赭曲霉毒素A标准品的检测，建立标准曲线，达到对含赭曲霉毒素A样品进行定量检测的目的。该发明可以用于小麦、谷物，饲料及其制品等样品中赭曲霉毒素A含量的检测。 

发明内容