[发明专利]GS-DHFR双基因筛选表达载体及其构建方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是一种GS-DHFR双基因筛选表达载体及其构建方法与应用。

背景技术

外源基因在哺乳动物细胞内的扩增是提高外源基因表达水平的重要策略之一。一般来讲，表达系统中的整个载体是由两个独立且连在一起的表达单元组成：外源基因表达单元和扩增基因表达单元，扩增基因往往亦为选择标记。迄今为止，世界上已经建立了十余种基因扩增选择系统，其中二氢叶酸还原酶(Dihyrofolate reductase，DHFR)基因扩增系统是最常用的基因扩增选择系统，而谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase，GS)扩增系统是新近发展的更有效的扩增表达系统。

二氢叶酸还原酶能够被叶酸类似物氨甲喋呤(Methotrexate，MTX)所抑制，用含有目的基因及之相连的DHFR基因的重组质粒转化CHO DHFR-细胞，利用浓度不断提高的MTX选择抗MTX的细胞系，其中DHFR基因及与之相连的目的基因一起扩增，从而使目的基因高水平表达(Looney JE，Hamlin JL.Mol cell Biol.1987；7(2)：569-577)。谷氨酰胺合成酶(GS)系统是近年来新发展的一种基因扩增系统。谷氨酰胺合成酶在ATP水解提供能量时，利用细胞内的氨和谷氨酰胺，在缺乏细胞外谷氨酰胺的培养条件下，加入谷氨酰胺合成酶的抑制物(Methionine sulphoximine，MSX)，可使GS基因及与之相连的目的基因扩增，达到提高目的基因表达水平的目的(Bebbington CR，Renner G，Thomson S，et al，Biotechnology.1992；10(2)：169-175.)。

有研究表明：GS系统表达水平高(刘文军，杨芙蓉，阮力，等，病毒学报，1997；13(2)：103-109)，但细胞长期连续培养时，生长状况不佳，而DHFR系统表达水平较GS系统低，但细胞生长良好(刘文军，杨芙蓉，阮力，等，高技术通讯，1997；7(2)：44-49)。所以，建立一个既能高效表达目的基因，又能维持良好细胞形态的筛选扩增系统，对于获得具有生产价值的基因工程细胞系很有意义，但目前没有见到这方面的报道，有研究表明，在原核系统中外源基因整合入宿主细胞的基因组中形成整合子(Integron)，基因表达水平与表达盒在插入位点的位置和顺序有关，由于GS系统和DHFR系统其各自的抑制物不同，目前较多见的是两个系统分别构建到不同的载体中然后共转化到宿主细胞中，通过加压选择获得高表达细胞系，而对于双表达系统的载体如何构建能够同时发挥二者的优势及起到协同的作用，目前并未见到报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种GS-DHFR双基因筛选表达载体及其构建方法与应用。该载体可以利用单一质粒实现外源基因的大量扩增和高效表达，简化了操作步骤，提高了转染效率，而且弥补了DHFR和GS单基因筛选系统的不足。

GS-DHFR双基因筛选表达载体，GS-DHFR双基因筛选表达载体，依次含有CMV启动子，外源基因插入位点、CMV启动子控制的二氢叶酸还原酶基因和SV40启动子控制的谷氨酰胺合成酶基因，谷氨酰胺合成酶基因下游为SV40polyA信号序列。

所述二氢叶酸还原酶基因序列与外源基因插入位点之间还有IRES序列。

所述外源基因插入位点为多克隆位点，具有Seq ID No.1所示的核苷酸序列。

上述GS-DHFR双基因筛选表达载体的构建方法，骨架载体为pOpti VEC，所述多克隆位点的核苷酸序列插入到所述pOpti VEC的IRES序列上游，所述谷氨酰胺合成酶基因插入在pOpti VEC的Pvu II位点，所述谷氨酰胺合成酶基因上游带有SV40启动子，下游为SV40polyA信号序列。序列如Seq ID No.5所示。

上述GS-DHFR双基因筛选表达载体的应用，其特征在于在所述外源基因插入位点插入目的外源基因，然后转入宿主细胞得到转化细胞；在缺乏谷氨酰胺的培养基中添加叶酸类似物氨甲喋呤和谷氨酰胺合成酶的抑制物对转化细胞进行加压筛选以获得高表达细胞系，对获得的高表达细胞系进行扩大培养，最后分离提取目的外源基因的表达产物。

所述宿主细胞为哺乳动物细胞。

所述哺乳动物细胞为CHO DG44细胞。

所述高表达细胞系为培养基中叶酸类似物氨甲喋呤和谷氨酰胺合成酶的抑制物的浓度分别为75uM和200nM的条件下加压筛选获得。

所述目的外源基因为人神经生长因子基因，其核苷酸序列如Seq ID No.2所示。