[发明专利]检测金霉素残留的免疫胶体金试纸条及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于兽药残留免疫学快速检测技术领域。具体涉及金霉素残留的免疫胶体金试纸条及其制备方法，适用于可食性动物组织中(肌肉、肝脏等)金霉素药物的残留快速检测。

背景技术

金霉素(CTC)是四环素类药物成员之一，为多环并四苯羧基酰胺母核的衍生物，具有广谱抗菌作用，对许多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有抑制或杀灭作用。由于这些药物具有确实的预防和治疗效果，价格便宜，在兽医临床应用十分广泛。在实际工作中，由于随意加大使用剂量和不遵守休药期，造成金霉素药物在动物组织中残留。金霉素药物长期残留在动物组织中，导致耐药菌在人类之间传播，严重损害人体健康。很多国家和国际组织通过建立动物性食品中兽药残留的有效检测方法，来控制该药物残留问题。如，我国和欧盟对CTC在动物组织中残留最高残留限量(MRL)作了明确规定：肌肉、肝脏和肾脏的MRL分别为100μg/kg、300μg/kg和600μg/kg。为了控制兽药残留，保障人类健康，有必要建立一种快速、有效的残留检测方法对其残留进行监测。

目前在动物性食品中金霉素的分析检测方法有很多，包括高效液相色谱法、薄层色谱法、液相色谱-质谱联用法、微生物法、酶联免疫法。但微生物方法存在检测时间长、缺乏特异性，容易导致假阳性和假阴性产生。仪器检测主要存在仪器购置费用昂贵、样品前处理复杂、程序繁琐费时、检测费用高、不能现场操作等缺陷，所以在生产中应用受到限制。ELISA方法灵敏度高、成本低，在药物残留检测中应用也很广泛，但该方法需要酶标仪等实验室设备，分析时间长，在应用中有局限性。近年来，胶体金免疫层析技术(GICA)与目前普遍采用的标记免疫分析技术相比，具有简便快速，特异性强、敏感性高，肉眼判断，实验结果易保存，无需特殊仪器设备等优点，因此GICA技术在药物残留检测领域得到了广泛应用。目前还没有针对金霉素残留检测的免疫胶体金试纸条及其制备方法报道。

本发明应用免疫学技术筛选出抗金霉素的单克隆抗体，通过胶体金的制备及胶体金标记条件的探索研究，在应用抗金霉素单克隆抗体和GICA技术研究建立抗金霉素单克隆抗体快速检测试纸条，并对其性能进行测定。试纸条检测范围较宽，假阳性低，检测灵敏、准确、可靠，适用于动物可食性组织如肌肉、肝脏等组织中金霉素残留的检测。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，制备一种能分泌抗金霉素的单克隆抗体杂交瘤细胞系。利用该单克隆抗体，建立一种特异性强、灵敏度高、且操作简单，对样品简单处理即可检测金霉素残留的免疫胶体金试纸条。同时组装一种金霉素药物残留的胶体金试剂盒，作为对可食性动物组织中金霉素药物残留的免疫胶体金试纸条的应用。

本发明的技术路线图见图1所示。

本发明的技术方案是：

一种金霉素药物残留的免疫胶体金试纸条，包括样品检测试纸的结构包括手控区：手控区封膜(1)、背板(2)、吸水垫(3)；测试区：硝酸纤维素膜(4)、质控线(5)、检测线(6)；样品端：结合垫(7)、样品垫(8)和样品端封膜(9)。其结构是：在背板(2)上按照顺序依次粘附手控区封膜(1)、吸水垫(3)、硝酸纤维素膜(4)、质控线(5)、检测线(6)、结合垫(7)、样品垫(8)和样品端封膜(9)；在质控线(5)上包被有兔抗鼠IgG一条；检测线(6)上包被有金霉素-牛血清白蛋白偶联物(CTC-BSA)一条；样品垫(8)上包被有所述的抗金霉素药物单克隆抗体-胶体金标记物。

一种适用于检测金霉素残留的免疫胶体金试纸条的制备方法，其步骤如下：

1)将半抗原金霉素采用赫夫曼消除反应后，再与牛血清白蛋白偶联合成偶联物(CTC-BSA)；

2)将步骤1)合成的偶联物(CTC-BSA)免疫原免疫小鼠，通过细胞融合筛选得到分泌抗金霉素药物的单克隆抗体的细胞株，将细胞株注射小鼠腹腔，得到抗金霉素单克隆抗体；

3)用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；

4)提取小鼠IgG免疫健康家兔，得到兔抗鼠IgG抗体

5)将步骤2)制成的抗金霉素单克隆抗体加入步骤3)制备的胶体金中，得到抗金霉素单克隆抗体与-胶体金标记物；

6)将抗金霉素单克隆抗体与-胶体金标记物包被在背板上；

7)将步骤1)合成金霉素-牛血清白蛋白(BSA)偶联合成偶联物(CTC-BSA)包被在硝酸纤维素膜(4)得到检测线(6)；

8)将步骤4)兔抗鼠IgG包被在硝酸纤维素膜(4)得到质控线(5)；