[发明专利]一种湿地嗜油假单胞菌株的基因及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种湿地嗜油假单胞菌株的基因及其应用。

背景技术

在油污染环境中存在着一定数量的微生物，这些微生物对受油污染环境有较好的适应能力。经过研究发现，这些微生物并非都可以应用于含高浓度石油烃废水、污泥的处理，只有对其经过严格的筛选和驯化后得到的嗜油菌株才有此作用。故嗜油微生物的首选取样点就是所要处理的污染环境中，初筛选出的嗜油微生物经过驯化后，即可作为嗜油微生物菌株应用到油污染废水与污泥的处理实践中。湿地环境与土壤环境的风化过程、温度、可利用的氧浓度、可利用的营养基质浓度、pH以及盐度等环境因素的特点有所不同，因此探索适合于湿地环境的微生物修复技术就变得非常重要。从黄浦江-长江口岸边湿地油污土壤中筛选出嗜油微生物，结合这些微生物的最宜生长条件与特性，将其应用于柴油的降解并研究其降解特性。

微生物的分类方法常用的有经典分类方法和分子生物学方法。经典分类方法主要指依据形态特征、培养特征及生理生化特征等分类方法。分子生物学分类法，又称分子分类方法，是指在分子水平上对生物个体的核酸及蛋白质进行研究，并据此对生物个体进行分类的方法。由于16S rDNA序列分析具有突出的作用，因此常被分子分类方法采用。目前，16S rDNA序列分析的方法主要有两种：一种是16S rDNA提纯后用反转录酶和保守引物进行测序，另一种是扩增16S rDNA基因对应的DNA序列，然后将PCR产物回收后直接测序。更进一步的可靠方法是扩增16S rDNA基因对应的DNA序列，将该序列做成感受态细胞，质粒扩增，然后对质粒进行测序。这是一种研究rDNA同源性最直接可靠的方法。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种湿地嗜油假单胞菌株的基因。

本发明的目的之二在于提供该基因的编码蛋白。

本发明的目的之三在于提供该基因在降解高浓度柴油污水中的应用。

一种湿地嗜油假单胞菌株的基因，其特征在于该基因具有下列核苷酸序列之一：

1)具有SEQ ID NO：1所示的碱基序列；

2)与SEQ ID NO：1所限定的核酸序列具有95％以上的同源性，且编码相同生物学功能蛋白质的DNA序列。

一种上述的一种湿地嗜油假单胞菌株的基因编码的蛋白，其特征在于该蛋白具有下列氨基酸序列之一：

1)具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；

2)通过将SEQ ID NO：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而产生的衍生蛋白质的氨基酸序列，该衍生蛋白质与SEQ ID NO：2的蛋白具有相同的生物学功能。

一种重组载体，其特征在于该重组载体含有上述的一种湿地嗜油假单胞菌株的基因。

一种宿主细胞，其特征在于该宿主细胞含有上述的重组载体。

上述的一种湿地嗜油假单胞菌株的基因在降解高浓度柴油污水中的应用。

一种克隆上述的一种湿地嗜油假单胞菌株的基因的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：

i.湿地产碱杆菌；

ii.对提取出的16S rDNA基因进行PCR扩增，扩增条件为：98℃预变性5min，95℃变性35s，55℃退火35s，72℃延伸1min 30s，35个循环，72℃延伸8min，扩增的引物是：P1正向引物为：5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3’，

P2反向引物为：5’GGTTACCTTGTTACGACTT 3’19bp；

iii.PCR产物的回收；

iv.对回收产物的片断TA克隆；

v.质粒提取，得到16S rDNA全序列。

采用BLAST分析法，将假单胞菌M3的16S rDNA全序列与GenBank数据库比较，该菌株与假单胞菌有很高的同源性。将其应用于柴油污水的处理中，考察其对油污的降解率特征。油污降解率计算公式如下：

菌株对油污降解率＝(空白含油率-接菌含油率)/空白含油率×100％

菌株在一周内对柴油的去除率为54.74％，降解率为15.89％。经气相色谱测定各组分特征，可见其对于C₁₅～C₂₆间的正构烷烃均具有较好的降解效果。表明本发明的湿地嗜油假单胞菌株的基因对柴油污染具有较好的降解效果。

附图说明

图1菌株M3的生长曲线

图2菌株M3的适宜生长温度

图3菌株M3的适宜生长pH值

图4菌株M3的适宜生长盐度

图5菌株M3降解柴油各组分特征

具体实施方式