[发明专利]使人的体细胞逆向分化产生自体生殖干细胞的方法、试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及领域属于生物医学技术领域，具体而言，本发明涉及一种使人的体细胞逆向分化产生自体生殖干细胞的细胞培养方法及其应用。 

背景技术

在哺乳动物中，生殖腺里的生殖干细胞来源于一种从胚胎传留下来的数量稀少的原始生殖干细胞。胚胎形成及卵巢或睾丸形成的过程中，原始生殖干细胞就只定居卵巢或睾丸。在卵巢或睾丸分化、发育和形成成熟的卵泡及卵子或精子是一个消耗过程。女性一生中，经过400至500次卵泡发育成熟、排卵和月经形成后，卵巢的生殖干细胞：原卵细胞就会枯竭，卵巢中就不再有原卵细胞和卵泡细胞，雌激素的主要来源也同时发生枯竭；卵巢萎缩变小，卵巢就衰老了。多数情况下，男性65岁开始睾丸的原始生殖干细胞也会逐渐枯竭。衰老枯竭的卵巢或睾丸使男女性不可避免地走向机体整体衰老的阶段，并且，影响男女性的寿命。 

自然的生殖干细胞不仅能分化形成包括精子和卵子在内的配子，具有生殖功能，还是一种能够分化形成多种细胞和组织的多能干细胞，具有再生性修复功能；而且，生殖干细胞还具有一定程度的增殖和传代能力，是唯一的能够复制和传递遗传信息的干细胞。所以，自体生殖干细胞在生殖系统的疾病和损伤的治疗领域，在男女性不孕不育的修复治疗应用领域，在抗衰老保健和延长寿命的应用领域以及建立自体生殖干细胞库的领域都有着十分重要的价值和意义。 

现在国际上主要采用两种方法制备生殖干细胞。一种方法是通过自然的胚胎干细胞体外分化形成异体生殖细胞，应用于研究领域；第二种方法是从睾丸或卵巢分离培养制备自体生殖干细胞，应用不孕不育的治疗领域，分离培养耗时困难，生殖细胞来源困难，获取数量极其稀少。 

体细胞是干细胞顺向分化产生的，具有某些具体功能的子代细胞。体细胞的染色体DNA和干细胞的染色体DNA在基因结构和基因的数量上并不存在差异。体细胞和干细胞之间的最主要的差别可能只是某些功能基因处于 不同的活性表达状态。功能基因表达的差异决定了细胞的具体功能和形态的差异。我们推测，干细胞向体细胞顺向分化的程序启动后，干细胞本身的干细胞特性决定基因的开关就被关闭，随后，干细胞就分化形成了具有某种特定功能的体细胞；换句话说，在体细胞染色体DNA序列中仍然存在生殖干细胞特性决定基因，例如Oct4、Nanog、C-kit、Dazl和Mvh基因等，这些基因只是处于关闭或静止状态。利用某些物质打开体细胞DNA序列中的生殖干细胞特性决定基因Oct4、Nanog、C-kit、Dazl和Mvh等基因开关，这些体细胞就可能重新逆向分化而形成新的自体生殖干细胞。 

在本项发明中，从血液单个核细胞等人的体细胞逆向分化，迅速产生百亿数量级别的自体生殖干细胞，不仅为疾病的潜在治疗和抗衰老保健提供了一种新的独特的多能干细胞，而且也为每一个不同年龄的人提供了建立自体生殖干细胞库，永久保存具有独特遗传信息的自体生殖细胞的潜在可能性。 

发明内容

本发明所要解的技术问题是：研发一种新的人的体细胞逆向分化产生自体生殖干细胞的干细胞生产调控技术，在不改变人的体细胞染色体DNA序列，不插入任何外来基因或DNA片段的情况下，应用含有某些植物提取物和蛋白的一系列配方，在体外重新激活体细胞DNA序列中的生殖干细胞特性决定基因开关，使这些体细胞重新逆向分化而形成新的生殖干细胞；另外，经冰冻长期保存植物和蛋白诱导性人自体生殖干细胞，建立个人的植物和蛋白诱导性自体生殖干细胞库。 

为了解决上述技术问题，本发明的一个目的是提供使人的体细胞逆向分化产生自体生殖干细胞的方法。本发明的另一个目的是提供采用该方法产生的自体生殖干细胞以及其在制备治疗多种疾病的药物中的应用。本发明的再一个目的是提供在上述方法中所采用的含有植物提取物和蛋白的多种细胞培养液以及该培养液的应用。此外，本发明还提供相应的用于制备自体生殖干细胞的试剂盒。 

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的： 

一方面，本发明提供一种使人的体细胞逆向分化产生自体生殖干细胞的方法，其中，所述方法包括：