[发明专利]一种高产脂肪酶基因工程菌及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种产脂肪酶基因工程菌，尤其是一种高产脂肪酶基因工程菌及其构建方法，属于遗传工程领域。

背景技术

微生物是脂肪酶(EC 3.1.1.3)的一个重要来源，而根霉又是微生物脂肪酶的重要生产菌。如今，已有超过30种根霉脂肪酶实现了商品化生产。根霉脂肪酶大都具有高度1，3-位置选择性，因此常用于油脂加工中。此外，根霉脂肪酶还具有稳定性佳、转化效率高等优点，被广泛应用于芳香酯、生物柴油、手性化合物的生产中。

本研究室从酿造浓香型大曲酒的酒曲中筛选到一株华根霉，从中克隆得到脂肪酶基因proRCL(GenBank Accession No.EF405962)，并在毕赤酵母中进行表达，表达量达到2200U/mL，荧光定量PCR鉴定表明该毕赤酵母基因工程菌含有一个拷贝数的脂肪酶基因。研究表明，毕赤酵母基因工程菌中外源基因的拷贝数与外源蛋白的表达量存在一定关系，增加拷贝数能够提高外源蛋白的表达量，但是拷贝数太高容易造成菌体负担过重，表达量反而下降。传统的构建和筛选高拷贝外源基因毕赤酵母基因工程菌的方法有很多，例如，通过将电转化液涂布于不同浓度的抗生素平板上，通过提高抗生素的浓度筛选高拷贝的基因工程菌，但是此筛选方法，需要准备不同抗生素梯度的平板，操作繁琐，价格昂贵(Invitrogen公司操作手册“Multi-Copy Pichia Expression Kit，Invitrogen，Version F”)。另外，还可以通过体外构建多拷贝表达盒的方法构建多拷贝基因工程菌，再电转化毕赤酵母。Zhu等在体外构建了猪胰岛素前体多表达盒，然后电转化毕赤酵母，从而获得含有多拷贝外源基因的毕赤酵母基因工程菌(Journal of Applied Microbiology，107(3)，954-963)。这类体外构建外源基因多表达盒的方法由于预先不能确定到底哪个拷贝数能够获得较高的表达量，需要体外构建含有不同拷贝数的表达盒，存在工作量大，耗时耗力的缺点。

发明内容

本发明所要解决的一个技术问题是提供一株高产脂肪酶基因工程菌。

所述基因工程菌基因组中含有多拷贝的华根霉Rhizopus chinensis CCTCC M201021脂肪酶基因。

所述脂肪酶基因的GenBank登录号为EF405962。

所述华根霉脂肪酶基因的拷贝数为3-22。

所述华根霉脂肪酶基因的最佳拷贝数为17。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种高产脂肪酶基因工程菌的构建方法，将含有华根霉(Rhizopus chinensis)CCTCC M201021脂肪酶基因的表达盒转化毕赤酵母，通过fast-blue顶层琼脂显色法显色，筛选颜色较深的基因工程菌，获得高产脂肪酶的基因工程菌，通过荧光定量PCR鉴定脂肪酶拷贝数。

本发明构建的高产脂肪酶基因工程菌，其脂肪酶活性可达12000U/ml，荧光定量PCR鉴定表明拷贝数为17，克服了现有毕赤酵母基因工程菌表达华根霉脂肪酶酶活偏低的不足，取得了极好的效果。本发明涉及的构建方法简单快速，具有如下优点：1)fast-blue顶层琼脂显色法将拷贝数与酶活力直接相关联，能够快速筛选得到含有最佳脂肪酶基因拷贝数的毕赤酵母基因工程菌(即能够表达脂肪酶酶活最高的基因工程菌)；2)避免了传统使用的高抗生素浓度平板筛选，不需要制作多块抗生素梯度平板，在一块MM平板上就能筛选获得不同拷贝数的基因工程菌，更加经济简便。

具体实施方式

以下通过实施例来进一步阐明本发明，下列实施例用于说明目的而非用于限制本发明范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，基本上都按照常见的分子克隆手册所述的条件进行操作。

材料及试剂：