[发明专利]一种酵母表达的牛乳铁蛋白衍生抗菌片段BLfA及其制备方法

权利要求书

1.一种酵母表达的牛乳铁蛋白衍生抗菌片段BLfA，其特征是具有4个牛乳铁蛋白分子中最强的分子表面阳离子特性，其中牛乳铁蛋白衍生抗菌片段BLfA基因的核苷酸序列为：

1      ATGGCCCCGAGGAAAAACGTTCGATGGTGTACCATCTCCCAACCTGAGTGGTTCAAATGC

61     CGCCGATGGCAGTGGAGGATGAAGAAGCTGGGTGCTCCCTCTATCACCTGTGTGAGGAGG

121    GCCTTTGCCTTGGAATGTATCCGGGCCATCGCGGAGAAAAAGGCGGATGCTGTGACCCTG

181    GATGGTGGCATGGTGTTTGAGGCGGGCCGGGACCCCTACAAACTGCGGCCAGTAGCAGCA

241    GAGATCTATGGGACGAAAGAGTCTCCCCAAACCCACTATTATGCTGTGGCCGTCGTGAAG

301    AAGGGCAGCAACTTTCAGCTGGACCAGCTGCAAGGCCGGAAGTCCTGCCATACGGGCCTT

361    GGCAGGTCCGCTGGGTGGATCATCCCTATGGGAATCCTTCGCCCGTACTTGAGCTGGACA

421    GAGTCACTCGAGCCCCTCCAGGGAGCTGTGGCTAAATTCTTCTCTGCCAGCTGTGTTCCC

481    TGCATTGATAGACAAGCATACCCCAACCTGTGTCAACTGTGCAAGGGGGAGGGGGAGAAC

541    CAGTGTGCCTGCTCCTCCCGGGAACCATACTTCGGTTATTCTGGTGCCTTCAAGTGTCTG

601    CAGGACGGGGCTGGAGACGTGGCTTTTGTTAAAGAGACGACAGTGTTTGAGAACTTGCCA

661    GAGAAGGCTGACAGGGACCAGTATGAGCTTCTCTGCCTGAACAACAGTCGGGCGCCAGTG

721    GATGCGTTCAAGGAGTGCCACCTGGCCCAGGTCCCTTCTCATGCTGTCGTGGCCCGAAGT

781    GTGGATGGCAAGGAAGACTTGATCTGGAAGCTTCTCAGCAAGGCGCAGGAGAAATTTGGA

841    AAAAACAAGTCTCGGAGCTTCCAGCTCTTTGGCTCTCCACCCGGCCAGAGGGACCTGCTG

901    TTCAAAGACTCTGCTCTTGGGTTTTTGAGGATCCCCTCGAAGGTAGATTCGGCGCTGTAC

961    CTGGGCTCCCGCTACTTGACCACCTTGAAGAACCTCAGGGAAACTGCGGAGGAGGTGAAG

1021   GCGCGGTACACC

2.一种制备权利要求1所述的牛乳铁蛋白衍生抗菌片段BLfA的制备方法，其特征是：

(1)从荷斯坦奶牛乳腺组织中克隆了BLf全长cDNA；以BLf全长cDNA为模板，设计引物PCR扩增了BLfA编码基因；

(2)构建了Pichia.pastoris重组表达载体pPICBLfA，BLfA在毕赤酵母摇瓶水平得到分泌表达，在甲醇诱导30h后达摇瓶水平最大表达量485mg/L；rBLfA经Ni-NTA His-Bind树脂纯化后纯度为93.8％；重组蛋白的去糖基化反应结果显示，rBLfA被糖基化修饰，表观分子量为43.0kDa；

(3)表达的rBLfA的重组菌株进行了细胞高密度发酵，产量分别为499mg/L，利用透明颤菌血红蛋白VHb在宿主菌胞内与rBLfA共表达，使rBLfA发酵罐水平的表达量提高了23％，达613mg/L，CO差光谱的结果表明，VHb在重组菌X-33(rBLfA-VHb)中得到了有效的表达。

结果，rBLfA的Fe³⁺结合能力为0.330，rBLfA释放Fe³⁺的pH范围为pH 7.0-3.5；rBLfA具有抑制金黄色葡萄球菌Staphyloccocus.aureus生长的功能，MIC为6.5μmol/L；