[发明专利]一种酶法合成Gal-sorbitol的方法

说明书

技术路线 

本发明涉及一种Gal-Sorbitol的酶法制备方法，具体地说是一种利用β-D-半乳糖苷酶催化乳糖和山梨糖醇合成Gal-Sorbitol的方法。 

背景技术

低聚糖(Oligosaccharides)是指由2～10个单糖组成的糖类，广泛存在于各种天然食物中。其中，功能性低聚糖具有某些独特的生理活性，包括低甜度、低热量，难以被人体消化吸收，食用后基本不增加血糖、血脂并能防止龋齿发生。糖醇是一种多元醇，一般具有与功能性低聚糖类似的生理功能和物理特性。一般来说糖醇含有两个以上的羟基，可以由来源广泛的、相应的糖来制取，即将糖分子上的醛基或酮基还原成羟基而成糖醇。国外把糖醇作为食糖替代品，广泛应用于食品工业，添加糖醇的甜食品称为无糖食品。糖醇因不被口腔中微生物利用，又不使口腔pH降低，反而会上升，所以不腐蚀牙齿，是防龋齿的好材料，糖醇对人体血糖值上升无影响且能为糖尿病人提供一定热量，所以可作为糖尿病人提供热量的营养性甜味剂。 

对于糖醇的合成，工业上采用的是传统的化学方法。化学法合成需要在高温、高压的环境下进行，造成其在基本建设投资及操作费用上花费较高，同时高压氢气易燃易爆容易造成安全隐患，再加上用镍作为催化剂在产品安全性方面也存在一定的问题，并且还会造成严重的环境污染，总体来说化学方法的工业化生产糖醇存在诸多的不足之处。 

近年来，一些科学们尝试采用酶法合成一些双糖醇。Klewicki(2000年)利用脆壁克鲁维酵母的β-D-半乳糖苷酶的水解和转糖苷基作用合成了Gal-erythritol、Gal-xylitol等。 

乳糖醇是一种双糖醇，具有比乳糖稳定，味觉和特性接近于砂糖等性质，其代谢与胰岛素无关，不增加血糖浓度，可供糖尿病人食用；同时，乳糖醇能促进人体肠道有益菌增殖，具有低能量、低致龋齿性等特点。目前，在食品和医药领域已经得到广泛的应用。作为乳糖醇的同分异构体Gal-Sorbitol也应该存在潜在的生理功能和应用，但国际上对其相关研究很少。 

发明内容

本发明的目的是采用利用β-D-半乳糖苷酶催化乳糖和山梨糖醇合成Gal-Sorbitol。 

本发明的技术方案包括利用β-D-半乳糖苷酶来催化合成反应，通过HPLC法检测各种反应产物。HPLC法无法确定的产物通过进一步的分离纯化后，进行¹H-NMR、¹³C-NMR和ESI-TOF-MS分析确定其结构组成。 

本发明专利以乳糖和山梨糖醇作为底物，由β-D-半乳糖苷酶来催化合成反应，得到乳糖醇的同分异构体——Gal-β-(1→3)sorbitol。 

附图说明

图1为β-D-半乳糖苷酶催化合成Gal-Sorbitol的酶反应液中糖类组成的典型HPLC图谱 

图2为Gal-Sorbitol的质谱图 

图3为Gal-Sorbitol的¹H-NMR图谱 

图4为Gal-Sorbitol的¹³C-NMR图谱 

具体实施方式

1、酶法合成反应 

称取0.4g乳糖和0.2g山梨糖醇置于螺口瓶中，再加入一定量蒸馏水后进行高压处理(121℃，20min)，使其完全溶解得到过饱和溶液，自然冷却至反应温度40℃。然后加入适量的醋酸-醋酸钠缓冲溶液(pH6.0)和蒸馏水调整溶液浓度至40％(w/v)。称取一定量的β-半乳糖苷酶(3U/mL)加入上述体系并置于40℃水浴中开始反应，然后每隔一定时间取样，沸水浴10min使酶灭活。用纯净水稀释一定倍数以后，进行HPLC分析。 

2、反应产物的测定方法 

采用HPLC外标法测定产物的含量。 

(1)糖标准溶液的制备。准确称取Gal-Sorbitol(经纯化得到)的标准样品，用水溶解后，加入等量的乙腈，配制成一系列不同浓度梯度的标准溶液，经0.45μm滤膜过滤后，按浓度从低到高的顺序进HPLC检测，记录各个浓度对应的峰面积，以各个浓度及其对应峰面积作图，得到各个糖的标准曲线。 

(2)色谱条件。色谱柱：Sugar-D(4.6×250mm，5μm，Nacalai Tesque Inc.，日本)；柱温：40℃；流动相：乙腈∶水＝75∶25(v/v)；流速：1.0mL/min；进样量：20μL。 

(3)根据糖标样的标准曲线，计算各种糖含量。 

3、反应产物Gal-sorbitol的纯化与结构鉴定