[发明专利]一种来源于苜蓿盲蝽的OBPs蛋白及其编码基因

说明书

技术领域

本发明涉及利用昆虫的嗅觉系统来进行害虫生物防治的技术领域；进一步，本发明涉及利用SMART技术构建触角cDNA文库以及结合生物信息学方法分离鉴定昆虫气味结合蛋白OBPs的方法及分离出来的苜蓿盲蝽气味结合蛋白基因。

背景技术

盲蝽蟓隶属于半翅目盲蝽科，是我国棉花生产上的一类重要害虫。1997年，我国开始商业化种植Bt棉花，到2007年Bt棉花的种植面积达到了380万公顷，占全国棉花总种植面积的69％。种植Bt棉花有效的控制了棉铃虫等主要鳞翅目害虫的危害，使化学农药使用量因此大幅度减少，随之，棉田害虫地位发生了一系列演替，盲蝽蟓种群数量剧增，危害加强，并且呈严重灾变趋势发生(Lu YH，Qiu F，Feng HQ，et al.Species composition and seasonal abundance ofpestiferous plant bugs(Hemiptera：Miridae)on Bt Cotton in china.CropProtection，2008，27：465-472)。据各地植保部门反映，近年来很多地方盲蝽蟓为害导致的棉花产量损失约为20％-30％，严重地区高达50％左右。棉田盲蝽蟓的严重发生还波及了枣、桃、苹果、樱桃、葡萄、茶树等农作物，已经成为影响多种农作物生产的重大问题。由于Bt棉抗盲蝽蟓效果较差，因此现在防治盲蝽蟓主要靠化学农药，这不仅容易导致棉铃虫等鳞翅目害虫抗药性的产生，而且对环境造成了巨大的破坏和污染，因此，有必要发展经济有效的、环境友好的防治方法。

嗅觉对于许多昆虫的生存和繁衍至关重要。昆虫在长期的进化过程中，发展演变了发达的触角系统(Field LM，Pickett JA and WadhamsLJ.Molecular studies in insect oltaction.Insect Mol.Biol.，2000，9(6)：545-551)。昆虫的触角系统是一个高度专一和灵敏的化学检测器，可以特异性识别环境中的化学气味分子，并依次觅食、寻偶、选择产卵的信息。而昆虫气味结合蛋白与脂溶性的气味物质发生作用，是昆虫专一性识别外界气味物质的第一步生化反应(Vogt RG and RiddifordLM.Pheromone Binding and inactivation by moth antennae.Nature，1981，293：161-163)。

昆虫气味结合蛋白(Odorant binding proteins，OBPs)是一类低分子量(16KDa左右)、等电点偏酸性(为4.0-5.0)、球状的水溶性蛋白，在昆虫识别外界气味物质中起着重要的作用，其主要存在于昆虫嗅觉感器淋巴液中。其作用是结合并运输脂溶性的气味分子通过水溶性的淋巴液到达嗅觉神经树突末梢(Pelosi P and Maida R.Odorant-bindingproteins in insects.Comp.Biochem.Physiol.，1995，111(3)：503-514)。

因此，深入研究OBPs不仅具有重要的理论意义，而且在实践中可以为害虫检测防治和益虫利用提供新途径、新方法，为研制开发无污染、不杀伤天敌、与环境相容性较好的高效引诱剂提供理论依据。也有利于阐明昆虫的嗅觉识别机制，同时对于研究脊椎动物的嗅觉识别机制也具有重要的启示意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种经分离得到的昆虫气味结合蛋白，及其编码基因；利用所发现的OBPs基因可以为害虫检测防治和益虫利用提供新途径、新方法，为研制开发无污染、不杀伤天敌、与环境相容性较好的高效引诱剂提供理论依据。

为达到上述目的，本发明的技术方案先提供一种从昆虫触角中分离鉴定气味结合蛋白基因的方法，包括步骤：

(1)利用SMART技术获得触角全长cNDA序列；

(2)Sfi酶双酶切所述ds cDNA；

(3)利用凝胶层析柱对酶切产物按片段大小进行分离，收集片段长度最长的ds cDNA；

(4)步骤(3)的ds cDNA和pDNR-LIB载体连接，得重组质粒；

(5)所述重组质粒转化ElectroMAX DH5α-E感受态细胞，得到未扩增的初始化cDNA文库；

(6)采用生物信息学的方法从cDNA文库中鉴别气味结合蛋白基因。

根据本发明的一个优选实施方案，本发明的方法的具体技术方案包括以下步骤：

(1)触角RNA的提取、反转录合成第一链cDNA及LD-PCR合成ds cDNA