[发明专利]一种以宣木瓜细胞培养法制备化合物齐墩果酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种细胞悬浮培养法制备生物药物的方法，具体地说是一种利用宣木瓜的外植体诱导愈伤组织，并进行细胞悬浮培养生产三萜类化合物——齐墩果酸的方法。

背景技术

人类对植物次生代谢物质的利用有着悠久的历史，次生代谢物是药用植物重要有效成分，但其受植物产量和次生物含量的限制，有些次生物质在自然界的含量甚微，从而局限了植物次生代谢物质的广泛应用；同时野生资源日益减少和栽培品种品质退化，给临床使用和质量控制带来许多困扰。随着生物技术方面的长足进步，人们把目光聚集在利用生物技术获取植物次生物质的研究上。为此，相关研究的科学家们经过近几十年的探索发现，通过植物细胞的规模培养，可以实现植物次生代谢物质“工厂化”高效生产。利用细胞培养生产有效成分，能缓解药用植物资源压力，对于那些生长条件要求严格、生长缓慢、产量小、采集困难、价值贵重的植物药，用这种方法更具有重要意义。

通过药用植物的细胞培养生产次生代谢物质有以下优点：(1)四季均可生产，不受地区、季节及有害生物的影响。(2)占地面积少，可对细胞生长自动控制和代谢过程合理调节，能够完全在人工条件下进行，可以排除病虫害与农药残留量的困扰，且能够严格控制药材的质量，便于进行大规模工业化生产。(3)便于筛选高产细胞株。通过优化培养液、培养条件和选择优良细胞系的方法，可得到含量高于整株植物栽培的次生代谢产物。研究资料显示，有40余种化合物在培养的组织细胞中含量高于完整植物水平。如培养的人参细胞中人参皂甙的含量是天然植物的5.7倍；雷公藤培养细胞中雷公藤内酯的含量是原植物含量的49倍。(4)利于生物转化，寻找新的有效药物成分。植物细胞内存在羟基化酶、氧化酶、还原酶、甲基化酶、酯化酶、糖基转移酶、糖苷酶等多种酶，植物培养物作为一种生物反应器转化外源化合物，能够产生原植物所没有的，甚至是至今自然界尚未发现的化合物。(5)个体差异小，生产周期短，设备简单，能节省人力、物力等。可以在人为提供的一定温度、光照时间、湿度、营养激素等条件下进行科学培养生产。根据需要，按不同药用植物外植体建立不同的培养条件，按几何级数大量繁殖生长，从而可提供大量的优质无病毒种苗和高产细胞株有利于自动化、规模化生产，提高生产效率。(6)利用组织培养过程中出现的芽变或人工诱变，或进行脱毒，培育新品种，提高药用植物品质。(7)保存种质资源。

宣木瓜，又名皱皮木瓜，学名为贴梗海棠Chaenomeles speciosa(Sweet)Nakai，属蔷薇科木瓜属，落叶阔叶灌木，为常用中药材木瓜的基原，具有很高的药用价值和食用价值。中医认为宣木瓜有舒筋、活络、健脾开胃、舒肝止痛、祛风除湿之功效，在临床上可用于预防和治疗风湿病、霍乱、痢疾、肠炎、脚气病及维生素C缺乏症等疾病。齐墩果酸是宣木瓜的主要药效成分之一。其是五环二萜类化合物，分子式为C₃₀H₄₈O₃，是木瓜的主要药效成分，纯品齐墩果酸为白色针状结晶，熔点为308～310℃，不溶于水，可溶于甲醇、乙醇、乙醚、丙酮和氯仿。有关资料表明，木瓜中齐墩果酸以单体形式存在。

齐墩果酸的主要生理功能有：

1抗肿瘤作用  近年来，人们对OA抗肿瘤的作用机制研究主要通过以下几方面进行：(1)齐墩果酸能抗DNA突变、抑制癌变的启动。(2)齐墩果酸具有肿瘤逆转作用及抗侵袭性。(3)诱导肿瘤细胞凋亡。(4)抑制肿瘤血管形成。总之，OA的抗癌作用几乎贯穿了肿瘤发展的各个阶段。

2保肝作用  齐墩果酸化学结构有双键、羟基、羧基等多个活泼官能团，易发生一些化学反应，如与体内毒性物质结合，起到解肝毒作用。齐墩果酸预处理也可防止四氯化碳诱导的肝谷胱甘肽的排空。动物实验还证实经预处理可将肝中金属硫蛋白(MT)增加了近30倍。经临床验证，齐墩果酸可有效治疗病毒性肝炎，是抗病毒性肝炎药的主要活性成分。

3降血脂、降血糖  早期文献报道，齐墩果酸可降低实验性糖尿病大、小鼠血糖水平，对实验性高血脂症大鼠和兔均有明显的降脂作用。

4对心血管作用  齐墩果酸对心血管疾病作用是其药理作用研究的新发现。有研究指出，齐墩果酸对实验性高血压大鼠无直接降压作用，但有直接的强心作用。当鉴于其同时具有降压、强心及抗心律失常作用，对于高血压合并心绞痛及心力衰竭的患者将是一个很好选择。