[发明专利]引物第3位引入突变的扩增阻滞法检测MDR1单核苷酸多态性

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术，是一种基于聚合酶链反应(PCR)的分子生物学方法，特别是涉及扩增阻滞法的聚合酶链反应(ARMS-PCR)，通过特异性引物3’端第3位引入突变，扩增多药耐药基因(MDR1)，达到对MDR1 rs1045642和rs2032582单核苷酸多态性(SNPs)进行基因分型的目的。优化实验条件后，构建简单、准确的MDR1rs1045642(C、T两种多态性)、rs2032582(G、T、A三种多态性)基因分型试剂盒。

背景技术

多药耐药基因(MDR1)是转运蛋白超家族成员之一P糖蛋白(P-gp)的编码基因。不同个体中MDR1基因多态性与P-gp表达和功能的改变密切相关。P-gp共有1280个氨基酸组成，是ABC(ATP binding cassette)家庭成员，能依赖ATP将其底物泵出细胞外，对细胞内化学物质的转运和药物浓度的维持起到关键作用。P-gp表达于正常组织，如肝脏、胃肠道、肾脏以及血脑屏障等细胞表面，影响药物转运及执行不同的生理功能。

研究发现MDR 1基因的多态性可以直接影响P-gp的表达，影响包括抗肿瘤药物、免疫抑制药物在内的多种药物的代谢动力学。并且可能与多种疾病如炎症性肠病的易感性、HIV的易感性与治疗、Parkinson病等的发病机制有关。而目前已知的MDR1基因的多态现象中，第26外显子MDR1C3435T(rs1045642)和第21外显子G2677T/A(rs2032582)具有重要的功能意义。因此，MDR1rs1045642、rs2032582SNPs的基因分型，可为研究MDR1基因的多态性及P-gp与药物代谢、疾病的发病机制间的联系提供技术分析的基础，具有较重要的临床意义。

目前，还未开发出简单、费用低廉的检测rs1045642、rs2032582SNPs的基因分型试剂盒，用于临床研究。本发明基于扩增阻滞法的聚合酶链反应(ARMS-PCR)，通过引物3’端第3位引入突变，扩增多药耐药基因(MDR1)，达到检测rs1045642与rs2032582单核苷酸多态性(SNPs)的目的，进行准确的基因型分析。

发明内容

本发明的目的是克服现有分子诊断技术中对MDR1SNPs差异性区分不够显著，提供了一种3’端第3位引入突变的引物，提高了各引物与SNPs区域的DNA结合的差异性，使PCR反应效率出现明显差异，而用于对rs1045642、rs2032582进行单核苷酸多态性的基因分型。引物包括用于rs1045642基因分型的SEQID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和rs2032582基因分型的SEQID NO.5、SEQID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ IDNO.9。

本发明第二个目的是提供一种配套SEQ ID NO.1-NO.9进行MDR1rs1045642、rs2032582单核苷酸多态性(SNPs)基因分型的特定的PCR反应程序，达到快速分析的目的，程序如下：94℃预变性2min后；进行十个循环的94℃变性10sec，61℃退火延伸1min；再进行二十个循环的59℃退火20sec，72℃延伸30sec。

本发明第三个目的是提供一种简便的对临床标本的rs1045642、rs2032582单核苷酸多态性(SNPs)进行检测的试剂盒。

本发明的技术方案概述如下：

一组用于检测MDR1rs1045642、rs2032582单核苷酸多态性(SNPs)的引物，分别针对rs1045642SNP的C或者T位点，或者rs2032582的G或者T或者A位点。针对rs1045642有上游引物SEQ ID NO.1和下游引物SEQ ID NO.2，及其含C多态位点的引物SEQ ID NO.3或含T多态位点的引物SEQ ID NO.4；针对rs2032582有上游引物SEQ ID NO.5和下游引物SEQ ID NO.6，及其含G多态位点的引物SEQ ID NO.7或含T多态位点的引物SEQID NO.8或含A多态位点的引物SEQ ID NO.9。

一种可对rs1045642、rs2032582单核苷酸多态性进行基因分型的PCR反应程序，其特征在于设定特定的PCR反应温度和时间，达到快速分析的目的。

一种检测rs1045642与rs2032582单核苷酸多态性(SNPs)的试剂盒：