[发明专利]基于核酸内切酶消化的甲基化DNA定量检测方法

权利要求书

1.一种基于核酸内切酶消化的甲基化DNA定量检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1，用亚硫酸盐处理待测DNA、和标准非甲基化DNA与标准甲基化DNA；

步骤2，在要检测的目标区域内，选择含多个CpG位点的一段序列，以所选序列5’端的一部分的作为正向引物，以所选序列3’端的一段序列的互补序列作为反向引物；

步骤3，以亚硫酸盐处理过的标准甲基化DNA和非甲基化DNA作为PCR模板，用所述步骤2所设计的正向和反向PCR引物，加入Taq DNA聚合酶，以实时定量PCR仪进行PCR扩增，并测定标准甲基化和非甲基化DNA扩增产物的解链温度；

步骤4，以亚硫酸盐处理的待测DNA样品作为PCR模板，在与步骤3相同的条件下，进行PCR扩增，得到PCR产物；

步骤5，将步骤4所得PCR扩增产物进行加热，使其温度高于标准非甲基化DNA相应的PCR扩增产物解链温度，而低于标准甲基化DNA相应的PCR扩增产物的解链温度；

步骤6，立即将步骤5中加热的PCR产物进行冷却，将冷却后的产物分为两部分，一部分加入单链DNA特异性核酸内切酶，另一部分不加单链DNA特异性核酸内切酶，在相同的反应条件下进行消化，得到消化产物；

步骤7，向步骤6所得消化产物中分别加入对双链DNA特异的荧光染料，用荧光分光光度计测定双链DNA的含量。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤1中所述亚硫酸盐具体为亚硫酸钠；所述亚硫酸盐处理待测DNA的处理方法为：以0.3M的NaOH变性待测DNA，加入由5M亚硫酸钠、0.5mM氢醌组成的pH值为5.0的混合液，60℃避光温浴4小时；脱硫并纯化DNA。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，使所设计的PCR引物为18~32碱基长度，在引物序列中所涉及的CpG位点数量可以为0~3个，且所设计的引物的3’端的最后一个碱基不处于CpG的C的位置；并使PCR扩增的DNA片段大小为80~180碱基长度，使PCR扩增的序列中含有尽可能多的CpG位点。

4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，在所述的引物序列中所涉及的CpG位点的C的位置，正向引物中用C/T混合代替C，反向引物中用G/A混合代替G。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述单链DNA特异性核酸内切酶为T7核酸内切酶 I、S1核酸酶或绿豆核酸酶中的一种或几种的混合。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述对双链DNA特异的荧光染料为SYBR Green Ⅰ。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述待测DNA为人类基因组DNA，所述标准非甲基化DNA与标准甲基化DNA为已确定的纯的非甲基化人类基因组DNA和已确定的纯的甲基化人类基因组DNA。

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述待测DNA样品为人类正常DNA，癌细胞DNA、肿瘤组织基因组DNA、血细胞DNA、血清DNA、体液DNA或排泄物DNA的样品。

9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，

所述癌细胞为肺癌细胞、胃癌细胞、结肠癌细胞、直肠癌细胞、肝癌细胞、乳腺癌细胞、淋巴癌细胞、膀胱癌细胞、卵巢癌细胞、肾癌细胞或胰腺癌细胞；

所述肿瘤组织为肺癌组织、胃癌组织、结肠癌组织、直肠癌组织、肝癌组织、乳腺癌组织、淋巴癌组织、膀胱癌组织、卵巢癌组织、肾癌组织或胰腺癌组织；

所述体液为血液、脑脊髓液、胃液、消化液、精液、唾液、泪液、汗液、尿液或阴道分泌液。