[发明专利]基于引物保护解除的甲基化DNA的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种甲基化DNA检测方法，尤其涉及一种基于引物保护解除的甲基化DNA的检测方法。

背景技术

DNA甲基化是指DNA链上CpG位点的胞嘧啶（C）残基的5’碳上被修饰了一个甲基。DNA甲基化是最早发现的DNA修饰之一，是表观遗传学的重要组成部分。DNA甲基化特征性地发生在DNA链上的CpG二核苷酸的胞嘧啶残基上，这常见于基因5’端表达调控序列。DNA甲基化在基因表达的调控中具有重要作用，参与了动物胚胎发育、基因印记和X染色体失活等过程。研究表明，DNA甲基化的改变能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及蛋白质互相作用方式的改变，从而控制基因表达。

DNA甲基化状态的改变是引起肿瘤的一个重要因素。CpG岛局部甲基化水平的异常升高，可以导致基因组的不稳定和抑癌基因的不表达。如果抑癌基因中有活性的等位基因失活，则发生癌症的机率就会提高。所以DNA甲基化引人注目的地方就是在肿瘤的早期检测中的应用，因为研究表明表观遗传的变化伴随肿瘤的发生与发展，检测DNA甲基化的改变可以有助于肿瘤的早期发现。

目前肿瘤甲基化的研究主要集中在抑癌基因。这是因为人们发现肿瘤的发生可能与抑癌基因启动子区的CpG岛甲基化造成抑癌基因关闭有关。由于CpG岛的局部高度甲基化早于细胞的恶性增生，因此DNA甲基化的检测可以用于肿瘤发生的早期预测。

CpG岛甲基化的检测方法众多，其原理分别基于甲基化敏感的限制性内切酶消化法和基于亚硫酸钠修饰DNA的PCR检测法。甲基化敏感性限制性内切酶/Southern法（methylation-sensitive restriction Endonuclease/Southern，MSRE- Southern）是比较传统的方法，灵敏度低，样品需要量大。甲基化DNA特异性PCR法（Methylation Specific PCR，MSP）及其衍生的甲基化DNA检测方法，是目前检测DNA甲基化的常用方法，具有高灵敏度的同时，假阳性率也很高。

发明内容

本发明提供了一种甲基化DNA的检测方法，通过设计带有荧光标记的尾引物，对DNA进行PCR扩增，然后进行电泳检测的方法，来判断是否存在甲基化DNA。

本发明甲基化DNA的检测方法，步骤如下：

步骤1，用亚硫酸盐处理并纯化待测DNA、标准非甲基化DNA和标准甲基化DNA；

步骤2，确定待测基因的检测区域，在所要检测的基因区域，选择一段含有多个CpG位点的序列作为目标检测序列进行引物设计，以该段序列的5’端的一段序列作为PCR正向引物，以该段序列的3’端的一段序列的互补序列作为PCR反向引物；在双侧引物的5’端加上一段尾引物序列，在正向引物5’端加上一段T7尾引物序列，在反向引物5’端加上一段T3尾引物序列；合成T7尾引物和T3尾引物，并对T7尾引物进行荧光标记；

步骤3，以亚硫酸盐处理过的标准甲基化DNA和非甲基化DNA作为PCR模板， 加入Taq DNA聚合酶和具有3’~5’外切酶活性DNA聚合酶，用所述的正向和反向PCR引物，对亚硫酸盐处理过的待测DNA进行PCR扩增；并以亚硫酸盐处理过的标准非甲基化DNA和标准甲基化DNA作为对照；

步骤4，以步骤3所得的PCR产物为模板，以所述尾引物进行第二次PCR扩增；

步骤5，用核酸分析仪测定步骤3所得PCR扩增产物的DNA片段在毛细管电泳的迁移率；

步骤6，将步骤5所测结果与标准DNA样品结果对照，如果待测样品中出现与标准甲基化DNA样品一致的迁移率信号，则存在甲基化DNA；反之，如果待测样品中不出现与标准甲基化DNA样品一致的迁移率信号，则表明待测样品中不存在甲基化DNA。

所述步骤1中，所用的亚硫酸盐为亚硫酸钠，用所述亚硫酸盐处理待测DNA的处理步骤为：以0.3M NaOH变性待测DNA，加入由5M亚硫酸钠、0.5mM氢醌、pH5.0的混合液，60℃避光温浴4小时；脱硫并纯化DNA。