[发明专利]一种基于荧光淬灭解除的DNA点突变检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种DNA点突变检测方法，尤其涉及一种基于荧光淬灭解除的DNA点突变检测方法。

背景技术

DNA的点突变（point mutation），也称为单碱基替换（single base substitution），是指由单个碱基改变发生的突变，在众多导致人类疾病的基因有义突变、病原体亚型以及耐药基因的有义突变中。人类的许多遗传性疾病都是由于基因的变异引起的，其中尤以单碱基的突变、即单碱基多态性最为普遍，所以DNA点突变与遗传疾病的关系日益受到重视。另外，随着医学科学的发展，人们已经发现许多肿瘤等疾病也起因于DNA的点突变。由于目前对这些疾病基本没有有效的治疗方法，因此，及时诊断非常重要。

因此，实现对这些DNA单碱基突变的早期、准确、简便、快速的确认，对于人类相关疾病的发病机理研究及早期治疗具有非常重要的意义。目前，为了准确的检测DNA点突变，医学科学工作者作了大量的研究，并取得了瞩目的成绩，有关单碱基突变的检测方法已有许多报道。

单链构型多态性分析技术（single-strand conformation polymorphism，SSCP）是最为广泛使用的，另外还有变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient  electrophoresis，DGGE）、错配裂解法（dismate cleavage，DC）、变性高效液相色谱分析（denaturing high-performance liquid chromatography，DHPLC）、毛细管电泳（capillary electrophoresis，CE）、碱基切割序列扫描（base excision sequence scanning，BESS）、等位基因特异性寡核苷酸杂交（allele-specific oligonucleotide hybridization，ASOH）、测序（sequencing）、等位基因特异性扩增（allele-specific amplification，ASA）等技术。这些技术是通过建立一系列电泳，分析DNA构象或接连特性，或者利用DNA变性和复性等特性，来进行DNA突变的分析。

但是这些传统的方法普遍操作繁琐费时、不易定量、仪器昂贵、且对工作人员要求较高的专业技能，因此仅能在少数实验室应用。开发一些简便、价廉、精确且易于临床推广的方法有着重要的意义。

发明内容

本发明提供了一种基于荧光淬灭解除的DNA点突变检测方法，通过设计合适的PCR引物，使引物靠近3’末端的碱基上标记报告荧光团，使3’末端标记有淬灭荧光基团，DNA发生点突变时，使用高保真DNA聚合酶将淬灭荧光基团移除，使这一引物上的报告荧光团发光。

本法明基于荧光淬灭解除的DNA点突变检测方法，步骤如下：

步骤1，提取待测样品的总基因组DNA；

步骤2，确定待测基因的已知点突变位点，在待测基因的已知点突变的位点的上游和下游区域分别选择一段序列设计正向和反向PCR引物，使其中一侧引物3’端的最后一个碱基正好在要检测的点突变的位置，使这一碱基与这一位置的正常序列一致或相匹配，并在这一引物3’端上标记淬灭荧光基团，在这一引物靠近3’端的碱基上标记报告荧光基团；

步骤3，以具有3’~5’DNA外切酶活性的高保真DNA聚合酶，用所述正向和反向引物对待测DNA样品进行PCR扩增；并以已知正常的DNA样品作为对照；

步骤4，检测报告荧光基团发射波长的荧光；若检测到所述报告荧光基团的发射波长的荧光，则所述待测DNA中存在点突变；若检测不到所述报告荧光基团的发射波长的荧光，则所述待测DNA中不存在点突变。

所述步骤2中，优选地，在所要检测的点突变位置的上游区域选择一段序列作为PCR的正向引物，使这一引物长18~32碱基长；在所要检测的DNA变异碱基下游区域选择一段序列并以该序列的互补序列作为反向引物，使反向引物序列长度为18~32碱基，以使PCR扩增的片段长60~180碱基。