[发明专利]一种有菌肿瘤组织全抗原的灭菌处理方法

说明书

技术领域

本发明属于肿瘤生物治疗技术领域，涉及第三类医疗技术的自体免疫细胞治疗，具体是涉及一种有菌肿瘤组织全抗原的灭菌处理方法。

背景技术

肿瘤是严重危害人民生活和健康的重大疾病之一。目前，恶性肿瘤是全球第二大导致死亡的疾病，也是中国城乡居民第一位死亡原因，中国每年新发病肿瘤患者总数约200万人，新增肿瘤患者年均增长率在10％左右。手术、化疗、放疗仍是肿瘤的主要治疗方法。但是，即使根治性手术也只能解决局部问题，不能避免全身转移。化疗、放疗存在的最大问题是其杀伤作用没有针对性，长期的化疗、放疗会损伤机体的免疫系统及各器官组织的功能，甚至诱发新的癌变。更为重要的是由于肿瘤细胞缺乏特异性的抗原、肿瘤细胞的抗原调变及MHC分子表达异常等因素导致肿瘤免疫逃逸，成为肿瘤治疗的一大难题。

由于传统的手术、放化疗的发展已进入平台期，人们把越来越多的目光投到肿瘤的生物治疗上。肿瘤生物治疗(Biotheropy)是应用现代生物技术及其产品进行肿瘤防治的新疗法，它通过调动宿主的天然防卫机制或给予天然(或基因工程)产生的针对性靶向性很强的物质来取得抗肿瘤的效应。随着对肿瘤发生发展分子机制的深入研究和生物技术的发展，生物治疗已经成为肿瘤综合治疗中的第四种模式。生物治疗对放、化疗不敏感及无法耐受放、化疗的老年患者来说是一大福音，可以明显提高患者的生活质量，延长患者的生存期，受到越来越多的重视。在37-39届(美国临床肿瘤协会会议)ASCO和第7届中国抗癌协会临床肿瘤学协作专业委员会(CSCO)年会上成为最令人瞩目、最鼓舞人心的焦点。

自体免疫细胞治疗是生物治疗中过继性细胞治疗的一类，是将自体的免疫活性细胞经过体外扩增后输入患者体内，直接杀伤肿瘤细胞，调节和增强机体的免疫功能。细胞治疗具有增殖速度快杀瘤活性高的特点，可直接杀伤患者体内残余肿瘤细胞，解除机体免疫抑制，增强患者的免疫功能，降低复发率和转移率，延长肿瘤患者的生存期并提高其生活质量。包括自然杀伤细胞(NK)、肿瘤浸润细胞(TIL)、细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、树突状细胞联合细胞因子诱导的杀伤细胞(DC-CIK)等。

其中树突状细胞(Dendritic cells，DC)是机体功能最强的专职抗原递呈细胞(Antigen presenting cells，APC)，它能高效地摄取、加工处理和递呈抗原，未成熟DC具有较强的迁移能力，成熟DC能有效激活初始型T细胞，处于启动、调控、并维持免疫应答的中心环节。DC作为目前发现的功能最强的APC，能够诱导特异性的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)生成。基于“双信号学说”的理论基础，DC联合CIK是目前最有效的细胞治疗的方法。

即使DC-CIK是最强的细胞治疗的方法，但是由于肿瘤细胞缺乏特异性抗原、免疫原性差，对肿瘤的杀伤性仍然很弱。目前解决这一问题的最好途径是：从患者的手术标本中提取全抗原，应用肿瘤全抗原或抗原多肽体外冲击致敏DC，回输或免疫接种于载瘤宿主，可诱发特异性CTL的抗肿瘤免疫反应，是目前最有效的抗肿瘤免疫反应。

令人遗憾的是肿瘤组织切除后暴露于体外环境后容易被污染，而人体的呼吸系统、消化系统本身是开放或半开放的系统，其术后的肿瘤标本便极可能是被大肠杆菌、球菌等污染的标本。肿瘤标本的无菌处理成为全抗原致敏DC细胞治疗肿瘤的桎梏，而现有技术中尚未见有很好地解决办法。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种有菌肿瘤组织全抗原的灭菌处理方法，以获得既安全又有效的肿瘤抗原致敏的特异性DC细胞，保证患者的安全。

本发明的目的通过以下技术方案实现。

本发明的技术方案主要基于以下认识：肿瘤全抗原的制备是一个复杂的过程，包括肿瘤组织标本的收集冻存、粉碎冻融、测蛋白浓度、无菌处理及刺激DC细胞等环节，其中来源于消化道、呼吸道等系统的有菌肿瘤标本的无菌处理是整个过程的关键环节，只有确保肿瘤抗原的无菌才能完成致敏DC细胞无菌培养，保证患者的安全，否则培养过程中细菌大量繁殖产生的内、外毒素会导致患者休克甚至死亡。

一种有菌肿瘤组织全抗原的灭菌处理方法，包括以下步骤：

1、制备肿瘤全抗原：

①将手术切出的肿瘤标本置于无菌缸中保存；

②在无菌环境下，用含庆大霉素100～160IU/ml的无菌生理盐水冲洗肿瘤标本2～3次；

③将肿瘤标本分切成组织块后置于冻存管中，在-86℃～-156℃环境下冻存、备用；