[发明专利]人表皮源性间充质干细胞样多能细胞及其制备方法

说明书

技术领域：

本发明属于生物细胞技术领域，具体涉及一种能用于从人表皮细胞分离得到人表皮源性间充质干细胞样多能细胞的细胞培养基和分离得到的人表皮源性间充质干细胞样多能细胞及其制备方法。

背景技术：

干细胞可分为胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞由于材料来源困难、伦理问题和异种(异体)免疫排斥反应等原因，不容易被应用到临床。成体干细胞存在于成体各种组织中。由于其材料来源广泛，可实施自体细胞移植，故在临床疾病治疗中有着广泛的应用前景。目前国内外分离成功的成体干细胞有间充质干细胞、表皮干细胞、神经干细胞、脂肪干细胞和胰岛干细胞等。但目前报道的这些成体干细胞要么生长速度缓慢，要么扩增代数有限，都不能在较短时间内(三个月)获得临床疾病治疗所需要的巨额细胞数。这也是目前妨碍成体干细胞应用到临床的瓶颈之一。

发明内容：

本发明的第一个目的是提供一种能用于从人表皮细胞分离得到人表皮源性间充质干细胞样多能细胞的细胞培养基，该细胞培养基还可以用于人表皮源性间充质干细胞样多能细胞的传代培养。

本发明的能用于从人表皮细胞分离得到人表皮源性间充质干细胞样多能细胞的细胞培养基为：在葡萄糖含量为0.5～5g/L的DMEM培养基中添加胎牛血清、hbFGF、hSCF、非必须氨基酸、L-谷氨酰胺、庆大霉素，并使各种添加成分的终浓度如下：胎牛血清：体积分数为10～25％、1～40ng hbFGF/mL、0.1～20ng hSCF/mL、0.1～2mL 100X非必须氨基酸/100mL、0.1～2mL含质量分数为3％L-谷氨酰胺的PBS溶液/100mL和1000～8000U庆大霉素/100mL。

本发明的DMEM培养基是公知的培养基，葡萄糖、胎牛血清、hbFGF(人碱性成纤细胞生长因子)、hSCF(重组干细胞因子)、100X的非必须氨基酸、L-谷氨酰胺、PBS溶液以及庆大霉素都属于现有技术的产品，要么能够根据现有技术配置，要么能够从试剂公司购买到。

本发明的能用于从人表皮细胞分离得到人表皮源性间充质干细胞样多能细胞的细胞培养基的配制方法是：在DMEM培养基中加入葡萄糖，搅拌均匀，使其终浓度为0.5～5g/L，形成一级基础培养基。然后在一级基础培养基中添加胎牛血清，hbFGF、hSCF、非必须氨基酸、L-谷氨酰胺、庆大霉素，并使各种添加成分的终浓度如下：胎牛血清：体积分数为10～25％、1～40ng hbFGF/mL、0.1～20ng hSCF/mL、0.1～2mL 100X非必须氨基酸/100mL、0.1～2mL含质量分数为3％L-谷氨酰胺的PBS溶液/100mL和1000～8000U庆大霉素/100mL，搅拌均匀后而制得能用于从人表皮细胞分离得到人表皮源性间充质干细胞样多能细胞的细胞培养基。所述的含质量分数为3％L-谷氨酰胺的PBS溶液是在每100mL的PBS溶液中加入3g的L-谷氨酰胺。

本发明的第二个目的是提供一种利用本发明的细胞培养基制备人表皮源性间充质干细胞样多能细胞的方法及其制备出的人表皮源性间充质干细胞样多能细胞。

本发明的人表皮源性间充质干细胞样多能细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

a)将人表皮细胞在上述细胞培养基中培养；

b)然后用消化液消化，祛除未消化下来的人表皮细胞，收集消化下来的间充质干细胞样细胞，即为人表皮源性间充质干细胞样多能细胞。

该人表皮源性间充质干细胞样多能细胞在体外条件下进行传代培养，因此本发明的第三个目的是提供本发明的人表皮源性间充质干细胞样多能细胞的传代培养方法，该方法为：以本发明的细胞培养基作为传代培养基，于36±1℃、5±1％CO₂、90～100％湿度下进行传代培养，而获得人表皮源性间充质干细胞样多能细胞株。本发明的人表皮源性间充质干细胞样多能细胞生长速度快，隔1～4天就可以1∶3的比例传代一次，可在3个月内传30代以上，且至少可以从每个临床废弃的皮肤标本从约3×10⁴个细胞开始三个月内获得2×10¹⁶个新的成体干细胞。

所述的人表皮细胞的优选获取方法是：取包皮或其他皮肤组织，用II型组织酶消化获得表皮，将表皮剪碎，再用胰蛋白酶进一步消化，获得表皮细胞。

所述的人表皮细胞在上述细胞培养基中培养，优选培养条件为：36±1℃、5±1％CO₂、90～100％湿度，每隔2-3天更换细胞培养基。