[发明专利]黑杨PdERECTA基因的功能分析与利用

说明书

技术领域

本发明设计涉及来自黑杨(Populus del toides)的PdERECTA基因功能分析与应用。

技术背景

黑杨(Populus deltoides)又叫欧美杂交杨，它具有生长迅速、适应性强、繁殖容易、造林成活率高、用途广泛等特点，深受广大林农的欢迎。但其耗水量大，喜湿润，因此成为其在我国干旱，半干旱地区推广的主要障碍之一。气孔作为植物吸收CO2和进行蒸腾作用的主要器官，对植物的水分利用效率有着巨大的影响。ERECTA基因编码的类受体激酶，在植物叶片发育的气孔密度调节的信号转导过程中有重要作用。其对气孔密度起负调控作用。该基因的表达可导致叶片气孔密度减小，对蒸腾作用的影响远大于光合作用，因此可提高水分利用效率。

发明内容

本发明的目的是提供黑杨中的一种与水分利用效率相关的ERECTA基因，该基因在黑杨中克隆，在提高水分利用效率中具有重要作用。本发明所提供的ERECTA基因来源于黑杨，是ERECTA基因家族中的一个，命名为PdERECTA。

序列表中序列氨基酸残基序列是由947个氨基酸残基组成的蛋白质，。

水分利用效率相关基因PdERECTA是下列核苷酸序列之一：

1)序列表中序列1的DNA序列。

2)与序列中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

序列表中序列1的DNA序列由947个碱基组成，为该基因的开放读码框序列。

本发明所提供的水分利用效率相关基因PdERECTA，使用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的表达载体(包括双元农杆菌载体以及用于单子叶植物微弹轰击的载体)转化植株，可获得水分利用效率提高的转基因植株。本发明的基因在构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种强启动子或诱导型启动子。本发明的基因在构建到植物表达载体中时，可以使用增强子，但是必须与编码序列的阅读框相同，要保证整个序列的翻译。

为了便于对转基因植物细胞或植株进行鉴定及筛选，可以在构建载体时对载体进行加工，例如加入可选择性标记，通常使用的可选择性标记可以是编码对抗生素(包括庆大霉素、卡那霉素、潮霉素)抗性酶的基因和生物安全标记(甘露糖)，也可以是GUS、GFP等可以产生颜色变化的酶或发光化合物的基因等。

携带有本发明的水分利用效率相关基因PdERECTA基因的表达载体可以通过多种方法转化植物宿主，以培育高水分利用效率的植物品种，例如Ti质粒、Ri质粒、电穿孔、微注射、植物病毒载体、直接DNA转化或植物病毒载体等，所转化的植物宿主可以是单子叶植物也可以是双子叶植物。

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明：

附图说明

图一是通过RT-PCR技术克隆得到的基因全长电泳图，图中M为markerIII，1为与水分利用效率相关的基因PdERECTA；

图二为PdERECTA基因在不同胁迫下RT-PCR检测结果。

具体实施方式

实施例1，黑杨总RNA的提取

用CTAB(萨姆布鲁克，分子克隆实验指南，第三版)的方法从盐处理的黑杨中提取总RNA。

实施例2，黑杨PdERECTA cDNA序列的克隆

总RNA用逆转录酶反转录合成cDNA，然后用引物GP1_{(CA(C/T)CA(A/G)A(G/C)TGAAGC(A/T)GATCC)}和GP2_{(GGAGG(A/G/C)GGCAT(A/G/T)ATGTCAT(A/G))}对该cDNA进行PCR。PCR程序为：(1)94℃，变性5分钟。(2)PCR扩增，35个循环：94℃，变性50秒；63℃退火50秒；72℃，延伸50秒；(3)72℃，延伸10分钟。将PCR产物用琼脂糖进行电泳分离，然后用天根的琼脂糖DNA分离试剂盒回收目的片断并与TaKaRa公司的pKM1304载体进行连接，连接的反应体系为：目的片断4μl，1μlpKM1304vector，5μl Solution I，于16℃过夜连接，再将连接产物转化进感受态的大肠杆菌Top10，用PCR的方法检测阳性菌株，最后取转化成功的菌株在上海生工进行DNA序列测定。

实施例3，黑杨PdERECTA基因在逆境中的表达特性