[发明专利]鲤春病毒血症抗原表位

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域。

背景技术

我国是水产养殖大国，水产养殖总量世界第一，水产品出口量占世界第一。鲤春病毒血症（SVC）是鱼类最主要的疾病之一，以发病急、死亡率高为特征。鲤春病毒血症病毒的宿主范围很广,能感染四大家鱼和其他几种鲤科鱼,包括鲤鱼和锦鲤、鳙鱼、草鱼、鲢鱼、黑鲫、鲫鱼、丁鳜和欧鲇等,鲤鱼是其中主要的、最易感的宿主。近几年来该病在我国大部分地区均有发生，，已成为我国淡水养殖鱼类的主要病害。鲤春病毒血症是水产动物一类传染病，是鱼类口岸检疫的第一类检疫对象。

目前, 在我国对SVC病毒的检测方法主要是病毒分离后用RT-PCR。PCR 技术虽然具有高灵敏度的优越性, 但缺点是：

1、结果判断上常常会出现假阳性的情况；

2、需要专业人员和昂贵的仪器试剂；

3、不符合国际兽疫局（OIE） 推荐的检测方法。

发明内容

本发明通过噬菌体展示技术，利用鲤春病毒血症病毒（SVCV）单克隆抗体筛选出阳性克隆，找出与SVCV单克隆抗体结合的保守序列，筛到的抗原型表位制备临床诊断试剂，小分子抗原肽作为疫苗防治鲤春病毒血症。

 本发明基因序列是SEQ　ID　NO：1。

本发明鲤春病毒血症抗原表位在制备鲤春病毒血症疫苗的应用。

本发明利用噬菌体展示技术，通过SVCV单克隆抗体筛选阳性克隆，找出在随机肽库中能与中和SVCV活性的单克隆抗体结合的保守序列。确定该抗原决定簇的位点，分析其序列，结构与功能的关系；研究小肽竞争与SVCV受体结合，针对SVCV而产生抑制作用，对未来小分子抗原肽作为疫苗，将具有巨大的应用价值。

附图说明

图1是本发明第1、2 轮筛选6 次洗脱扩增的噬菌体克隆点杂交结果；

图2是本发明第3 轮筛选3 次洗脱扩增的阳性克隆点杂交结果；

图3是本发明短肤触合蛋白组的设计表达与纯化；

图4是本发明抗原表位在ELISA和Westernblot的结果中，均被免疫血清所识别；

图5是本发明短肽融合蛋白与细胞结合活性测定；

图6是本发明加入抗血清后短肽蛋白与细胞结合活性测定；

图7是本发明阳性杂交瘤细胞染色体形态；

图8是本发明2A3抗体与不同浓度抗原结合的ELISA曲线图；

图9是本发明3H7抗体与不同浓度抗原结合的ELISA曲线图；

图10是本发明SVXV 单克隆抗体正辛酸纯化的SDS-PAGE电泳结果；

图11是本发明2株腹水与抗原的反应结果。

具体实施方式

 本发明鲤春病毒血症抗原表位基因序列是SEQ　ID　NO：1。

本发明鲤春病毒血症抗原表位在制备鲤春病毒血症疫苗的应用。

一、鲤春病毒血症病毒(SVCV)单克隆抗体制备

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂

弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂和二氨基联苯胺（DAB）以及青霉素G（钠盐）和链霉素（硫酸盐）购自北京鼎国生物技术公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG购自北京中山生物技术公司；RPMI-1640培养基、100倍HT和100倍HAT、HEPES、二甲基亚砜（DMSO）、聚乙二醇4000、秋水仙素、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、十二烷基硫酸钠（SDS）、过硫酸铵、PNA,β-巯基乙醇和硝酸纤维素膜购自Sigma公司；抗体亚类鉴定试剂（IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgA）购自Pharmacia公司；低分子量标准蛋白（97.4、66.2、43.0、31.0、20.1和14.4kD）购自TaKaRa公司；胎牛血清购自HyClone公司；其它试剂均为进口分装或国产分析纯化学试剂。

1.1.2 鲤春病毒血症病毒

鲤春病毒血症病毒本实验室保存

1.1.3 实验动物  

BALB/c小鼠购自长春生物制品研究所实验动物中心。

1.1.4 细胞株 

SP2/0骨髓瘤细胞为军事医学科学院十一所细菌室保存。EPC购自中科院上海细胞所

1.1.5 主要培养液及缓冲液

青、链霉素（双抗）溶液：取青霉素G（钠盐）100万U和链霉素（硫酸盐）1g， 溶于100ml去离子水中，过滤除菌，分装小瓶，-20℃保存备用。