[发明专利]高效定量分析小鼠耳蜗听觉神经元和毛细胞的体视学方法

说明书

所属技术领域

本实用新技术属于基础医学实验研究技术，该技术发明采用生物医学实验室常规的组织样品制备术，结合体视学软件控制的显微镜观察和成像技术，用厚度为40微米的树脂包埋的耳蜗连续切片，对耳蜗的听觉神经元和毛细胞进行定量的形态学分析，该技术属于耳蜗细胞病理分析实验技术。

背景技术

小鼠内耳的听觉感受器-柯迪氏器是一个非常精细和娇嫩的器官，小鼠的柯迪氏器长度仅约6毫米。鉴于小鼠在听力研究中的重要地位，建立高效的小鼠耳蜗组织学切片法和定量分析柯迪氏器的听觉神经元、内毛细胞和外毛细胞的技术非常必要。柯迪氏器的感受器细胞和耳蜗听觉神经元的数量是判断听力功能正常与病理变化的重要基础指标。

用传统的耳蜗组织平面制备技术获得的平铺蜗管片段可用相差显微镜和扫描电镜对听觉细胞进行细胞病理分析^[1-3]，这种耳蜗平铺制备法对于观察和分析整个耳蜗的听觉细胞形态变化非常有效。但这个技术有缺陷，在显微解剖切割螺旋窝管时螺旋神经元(SGN)容易丢失，并有将螺旋窝管纽曲展平的嫌疑。该技术经改进尽管克服了SGN丢失的缺陷，但用该技术制备的耳蜗片段不适用于无偏见的体视学方法估算耳蜗的SGN的总数^[4]。

为了定量分析耳蜗的毛细胞和SGN，研究者采用不同的耳蜗制备法定量毛细胞和SGN，例如用左耳蜗定量SGN的密度，而用右耳蜗定量毛细胞^[5-6]。以上的耳蜗制备技术都需要很高的解剖技巧和熟悉耳蜗的组织结构，并且要花费大量的时间。计算机辅助的三维图象重建用于毛细胞损伤丢失和位置测量方法的建立，克服了传统耳蜗制备方法的一些缺点，但大量图象的比较和拼接仍需花费很多时间。最近几年，有研究者采用激光共聚焦显微镜技术和三维图象重建术对树脂包埋经免疫细胞化学染色的耳蜗组织进行细胞形态学和立体学研究^[7]，这种方法能特异性标记听觉毛细胞和SGN，并在耳蜗细胞频率图上定位损伤和丢失的毛细胞，尽管这一方法样品制备较容易，制备好的样本可用多种途径进行研究，但其缺点是荧光素与树脂的相容性较差，标记抗体不易穿透整体包埋的耳蜗，因此要获得清晰的图象也非易事。

我们采用实验室常规的制备电镜观察标本的树脂包埋法制备耳蜗材料，将包埋的耳蜗组织切成厚的连续切片，用体视学分析软件和计算机精确控制的电动三维显微镜平台在显示器上示踪细胞的形态、损伤丢失和频率位置，用体视学分析软件对耳蜗总的SGN的数量进行无偏见的定量分析^[8]，用一个耳蜗组织就能进行听觉毛细胞和SGN的定量分析，这一方法大大缩短了从样品制备到分析数据获得的时间，另外样品制备不需要很高的解剖技术。

参考文献：

1.Engstrom，H.，Ades，H.W.and Andersson，A.(The Williams and Wilins Co.，Baltimore，1966).

2.Bohne，B.A.Location of small cochlear lesions by phase contrast microscopy prior to thinsectioning.Laryngoscope 82，1-16(1972).

3.Santi，P.A.Organ of Corti surface preparations for computer-assisted morphometry.Hear Res 24，179-187(1986).

4.Bohne，B.A.& Harding，G.W.Processing and analyzing the mouse temporal bone to identifygross，cellular and subcellular pathology.Hear Res 109，34-45(1997).

5.Keithley，E.M.& Feldman，M.L.The spiral ganglion and hair cells of Bronx waltzer mice.HearRes 12，381-391(1983).

6.Spoendlin，H.& Schrott，A.The block surface method for evaluation of human inner ears.ActaOtolaryngol Suppl 436，25-36(1987).