[发明专利]高启动强度宽宿主范围组成型表达质粒pETPc及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及的是基因工程领域表达质粒及应用，尤其是关于高启动强度宽宿主范围组成型表达质粒pETPc及其在生物降解和生物修复领域的应用。

背景技术

基因表达系统在生物降解和生物修复领域具有重要作用，是进行外源基因表达的重要工具。现在常用的基因表达系统，比如tac启动子表达系统、Tn7启动子表达系统以及一些光照诱导型或者温度诱导型启动子表达系统等，都有一个共同的缺陷，即启动子诱导表达需要额外添加诱导因子，如IPTG、温度变化、光照变化等。这为生物降解和生物修复带来了额外的操作，增加了成本，而且，在环境领域应用时增加了表达系统实施的难度，并可能会给环境带来负面的影响(Di Gennaro et al.，2008；Choi et al.，2005)。因而，有必要开发新的不受上述限制的组成型表达质粒。

芳烃类化合物是一类重要的致癌物质，在环境中广泛存在，不但对环境造成了严重污染，而且严重威胁人类健康。利用微生物，通过生物降解和生物修复来消除环境污染已经成为现在重要的研究课题。儿茶酚又称邻苯二酚，是许多芳烃类化合物代谢的中间产物。儿茶酚双加氧酶能够作用于芳烃类化合物代谢的中间产物邻苯二酚，它催化苯环的邻位裂解。这一特性使该酶在芳烃类化合物代谢中处于重要的地位，对消除芳烃类化合物的环境污染具有重要的意义。

参考文献

Di Gennaro P，Ferrara S，Bestetti G，et al.Novel auto-inducing expression systems for the development of whole-cell biocatalysts.Appl Microbiol Biotechnol，2008，79：617-625.

Choi K H，Gaynor J B，White K G，et al.(2005)A Tn7-based broad-range bacterial cloning and expression system.Nat Methods，2005，2：443-448.

发明内容

针对现有质粒的缺陷以及现阶段环境污染的现状，本发明的目的是提供一种高启动强度宽宿主范围的组成型表达质粒，并使其应用于在革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌中表达儿茶酚双加氧酶。

本发明所述高启动强度宽宿主范围组成型表达质粒，命名为pETPc，由复制子ori₁₆₀₀、筛选标记基因Kan(卡那霉素抗性基因)、多克隆位点、基因间序列和高启动强度组成型启动子Pc；其特征在于，所述质粒pETPc的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；其中，所述高启动强度组成型启动子Pc的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明所述的质粒pETPc的构建方法是：

合成启动子Pc，共225bp。

以上述合成的Pc片段为模板，设计引物如下：

Pc.f(划线部分为MluI酶切位点)CATGACGCGTTGCCGATACAAGAACAA

Pc.r(划线部分为XbaI酶切位点)GTCATCTAGAACGGGTTCGCTACCTGC

然后配制反应体系：ddH₂O 34μl，dNTP Mixture(2.5mM each)4μl，10×Easy Taq Buffer 5μl，Sense Primer(20μM)0.5μl，Anti Primer(20μM)0.5μl，模板DNA(合成的启动子Pc片段)0.5μl，Easy Taq 1μl。

体系配好以后进行聚合酶链式反应(PCR)，循环如下：

94℃4min；之后94℃30s，55℃30s，72℃30s，共29个循环；最后72℃10min。

分别用相应的核酸内切酶对扩增产物和宽宿主范围表达质粒pET28a(核苷酸序列如SEQID No.3所示)进行酶切，DNA连接酶连接，进行鉴定，获得阳性重组质粒，命名为pETPc；所述质粒pETPc的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

本发明所述质粒pETPc在革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌中表达儿茶酚双加氧酶的应用。其中，所述儿茶酚双加氧酶的表达是以在质粒pETPc启动子Pc后插入儿茶酚双加氧酶的基因bphC(核苷酸序列如SEQ ID No.2所示)实现。