[发明专利]一种猪细小病毒灭活疫苗的制备方法

权利要求书

1.一种猪细小病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)ST细胞或IBRS-2细胞的复苏培养；

用方瓶培养从液氮中复苏的ST细胞或IBRS-2细胞，培养条件包括：pH值7.0～7.3、温度35～37℃，培养基为DMEM；培养48～72h，培养至细胞浓度为3～6×10⁵cells/ml，即可；

(2)ST细胞或IBRS-2细胞的生物反应器微载体培养；

细胞接种密度为1～2×10⁵cells/ml，微载体浓度为3～5g/L，溶氧为30％～60％，pH值7.0～7.3，温度35～37℃，转速40～60r/min，培养基为DMEM；培养至细胞浓度为3～5×10⁶cells/ml；其中，微载体为球状载体Cytodex1或片状载体；

(3)ST细胞或IBRS-2细胞的生物反应器微载体的连续培养；

以一定速度向生物反应器中连续添加新鲜的DMEM培养基，同时用相同的速度向外排出培养好的ST细胞或IBRS-2细胞，保证ST细胞或IBRS-2细胞在反应器中停留时间内扩增至浓度为3～5×10⁶cells/ml，即可；

(4)接种猪细小病毒培养；

将猪细小病毒接种于连续培养ST细胞或IBRS-2细胞的生物反应器中进行培养，接种MOI为0.01，培养条件包括：溶氧30-60％、PH值7.1-7.4、温度35-37℃，使病毒含量达到≥10^6.0TCID₅₀/ml；

(5)收集病毒液，灭活病毒，制成猪细小病毒灭活疫苗。

2.根据权利要求1所述的猪细小病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于：在步骤(1)中，在所述的DMEM培养基中，添加有体积浓度为5～10％的血清。

3.根据权利要求1所述的猪细小病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，所述的一定速度为2～3个生物反应器体积/天。

4.根据权利要求1所述的猪细小病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于：步骤(4)中，在培养过程中，监控葡萄糖的消耗、乳酸的产生和氨的产生，并对球状载体Cytodex1上细胞进行计数。

5.根据权利要求4所述的猪细小病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于：所述的球状载体Cytodex1上细胞计数，先用PBS漂洗2次，经0.1％结晶紫的柠檬酸溶液染色，用血球计数板计数细胞核。

6.根据权利要求1所述的猪细小病毒灭活疫苗的制备方法所制得的疫苗产品。