[发明专利]一种与绵羊眼肌性状相关的SNP及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程领域中一种利用单核苷酸多态性预测绵羊眼肌性状的方法。

背景技术

根据一个物种已知的基因序列设计简并引物是获得另一个物种未知基因的一种发法。获得基因后可以利用生物信息学手段对新基因进行功能预测，并通过半定量RT-PCR和荧光定量PCR对该基因进行组织表达分析，通过多态性分析进行验证。钙蛋白酶抑制蛋白(Calpastatin，CAST)基因在小鼠、人、兔和牛等物种存在不同的转录本，而且不同的转录本在不同组织中的表达存在差异(Emori et al.，1987，Proc Natl Acad Sci USA 84(11)：3590-3594；Killefer andKoohmaraie，1994，J Anim Sci 72(3)：606-614；Takano et al.，2000，JBiochem 128(1)：83-92)。Zhu等人发现CAST在睾丸组织中存在一新的亚型，克隆了新基因，并推测可能与精子的发生与关(Zhu，H.et al.，2002，Acta Pharmacol Sin 23(5)：450-454)。

单核苷酸多态性标记(single nucleotide polymorphism，SNP)是1996年被美国MIT的E.Lander提出的，被称为“第二代DNA遗传标记″。其基本原理是：对于一个经PCR扩增后具有固定长度的DNA片断，其分子构象是由碱基序列所决定的，因此单个碱基的改变能够引起DNA分子单链或等位基因间形成的错配异源双链在变性条件下存在微小的构象差别，这些不同的构象体在电泳或高效液相检测中因移动性的差异而得以区分。SNP的检测可以通过PCR-SSCP、PCR-RFLP、测序及SNP芯片等多种技术实现。

目前知道牛的CAST基因存在四种转录本，但在羊上CAST基因的研究较少，而且GenBank上的序列不能清楚知道它属于CAST基因的那种转录本。有关羊CAST基因SNP的检测及功能验证研究还是一个空白，对于羊的标记辅助选择及育种带来很大的障碍。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种绵羊单核苷酸多态性标记，自SEQID No 1所示序列的5’端起第73位碱基为G或者A。

本发明还提供上述的绵羊单核苷酸多态性标记在绵羊眼肌性状预测中的应用。

本发明的目的是提供利用单核苷酸多态性检测绵羊眼肌性状的引物，其序列如SEQ ID No 2和SEQ ID No 3所示。

本发明提供的绵羊单核苷酸多态性标记在绵羊眼肌性状预测中的应用，具体是用上述的引物对绵羊的总DNA进行PCR扩增，然后再对PCR扩增产物进行单核苷酸多态性检测，确定自序列表中SEQID No 1的5’端起第73位碱基为G还是A，具有G等位基因的个体会有较大的眼肌面积和眼肌宽度，也即GG、GA基因型的个体的眼肌面积和宽度显著性的大于AA基因型。

所述单核苷酸多态性检测的方法为DNA测序、聚合酶链式反应-限制性酶切位点长度多态性、聚合酶链式反应-单链构象多态性或等位基因特异的寡核苷酸杂交。优选为聚合酶链式反应-限制性酶切位点长度多态性。其中限制性内切酶选用Nsi I。

本发明还提供含有SEQ ID No 2和SEQ ID No 3所述引物的用于单核苷酸多态性预测绵羊眼肌性状的试剂盒。该试剂盒还包括PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶、dNTPs、灭菌双蒸水。该试剂盒还可包括限制性内切酶Nsi I及其缓冲液。

本发明利用绵羊的CAST基因的SNP突变位点进行基因型快速分型。不同的绵羊群体存在这些多态位点上的基因型频率和基因频率存在显著差异。利用一般线性模型对CAST基因的CAST-S1的g.G73A的SNP位点与绵羊的生产性状进行关联分析，表明CAST-S 1的g.G73A突变与眼肌厚度和眼肌面积存在关联，其中GG型和AG型的眼肌厚度极显著高于AA型(P＜0.01)；GG型和AG型的眼肌面积显著高于AA型(P＜0.05)。该多态位点的检出，不仅为分子育种提供了新的素材，同时为绵羊眼肌性状的标记辅助选择提供科学依据。

附图说明

图1为CAST-S1扩增片段的SSCP结果。

图2为CAST-S1扩增片段的测序峰图。

图3为CAST-S1扩增片段的RFLP结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。