[发明专利]一种大豆北方茎溃疡病菌活性检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种微生物活性检测方法，特别是涉及一种大豆北方茎溃疡病菌(Diaporthe phaseolorum(Cooke et Ell)Sacc.var.caulivora Athow & Caldwell，DPC)的活性检测方法。

背景技术

大豆北方茎溃疡病菌(Diaporthe phaseolorum(Cooke et Ell)Sacc.var.caulivora Athow & Caldwell，DPC)是严重危害大豆生产的一种种传病原真菌，属子囊菌门、子囊菌纲、间座壳目、黑腐皮壳科、间座壳属，无性阶段为拟茎点霉属。

大豆北方茎溃疡病菌能侵染大豆植株的各个生长阶段，植株受侵染的茎组织部位易碎，表皮剥落，形成环形带的环状损伤，严重时导致植株死亡。受侵染的种子皱缩，变轻，外表白垩状。发病严重的田块有80％的植株受到侵染，产量损失高达50％，造成严重的经济损失。该菌主要以带病植物残体及种子进行远距离传播，种子带菌率达10％-20％。近年来该病害发展迅速，在美国、加拿大、阿根廷(Pioli et al.，2003)、厄瓜多尔、巴西(Costamilan et al.，2008)、保加利亚、克罗地亚、塞尔维亚、黑山、法国、意大利、俄罗斯、西班牙、韩国等国家及地区有发生报道，是国外大豆生产上的重要真菌病害。

病原菌活性检测是检验检疫的一项重要任务，对正确的评价有害生物的入侵风险具有重要意义。为了研究准确、灵敏、快速的检测方法，对大豆北方茎溃疡病菌的检测研究主要集中于分子生物学方面，这类方法如PCR等，能够提高检测效率，但是不能反映病原菌的活性情况。目前，大豆北方茎溃疡病菌活性检测依赖于传统的形态学鉴定方法，该方法因为需要通过10天左右的保湿培养，然后对培养物进行形态学鉴定，所以在进行病原菌形态学鉴定的同时也确定了其活性，因此，真正意义上的单独对大豆北方茎溃疡病菌的活性研究尚未有报道。虽然，通过形态学鉴定能够准确、可靠的检测出大豆北方茎溃疡病菌的活性，但是该方法耗时长，不能很好的满足实际检验检疫工作的需要。

发明内容

本发明的目的是针对上述大豆北方茎溃疡病菌活性检测时间长的问题，提供一种新的简便、快速的大豆北方茎溃疡病菌活性检测方法。

为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

本发明公开了一种大豆北方茎溃疡病菌活性检测方法，该方法采用激光扫描共聚焦显微镜观察经过荧光染料染色的大豆北方茎溃疡病菌孢子，优选的染料为碘化丙啶。

所述活性检测方法中碘化丙啶的染色终浓度为0.05μmol/L-2μmol/L，优选染色浓度为0.05μmol/L-0.06μmol/L。

所述碘化丙啶染料的染色时间为15min-30min，优选为15min，且染色过程于室温避光条件下进行。

由于采用以上技术方案，本发明的有益效果在于：

本发明的活性检测方法能够有效的区分大豆北方茎溃疡病菌孢子的死活，从制样到检测完成仅需要30分钟，可以直接对单个孢子的染色情况进行死活判断。本发明具有快速、准确、灵敏、重复性好等特点，有望替代传统的通过形态学检测活性的方法，适合于口岸检验检疫、农业生产、植物保护等部门使用。

附图说明

图1为本发明一种实施例的大豆北方茎溃疡病菌单个孢子活性检测图，图中A和B为活孢子的扫描结果图，A为激光扫描通道下的扫描结果，孢子内部没有荧光，B为明场通道下的扫描结果，C和D为死孢子的扫描结果图，C为激光扫描通道下的扫描结果，孢子内部显示红色荧光，D为明场通道下的扫描结果。

具体实施方式

本发明公开了一种大豆北方茎溃疡病菌活性检测方法，包括如下步骤：

(1)孢子悬浮液配制；用灭菌去离子水配置大豆北方茎溃疡病菌孢子悬浮液，收集于1.5mL离心管中，振荡混匀，10000rpm离心1min，弃上清收集孢子；再加入1mL灭菌去离子水洗涤孢子，10000rpm离心1min，弃上清，最后加入1mL灭菌去离子水重悬，获得孢子悬浮液，浓度约为105-106个/mL。

(3)孢子染色处理；采用染料对孢子悬浮液进行染色，优选的染料为碘化丙啶，染色条件为，室温下避光染色15min-30min，优选15min；离心移弃含有染料的上清液，终止染色，灭菌蒸馏水洗涤两次，重悬孢子，制片。所用染料碘化丙啶与孢子悬浮液混合后，碘化丙啶在混合液中的适合染色终浓度应在0.05μmol/L-2μmol/L，优选染色浓度为0.05μmol/L-0.06μmol/L。