[发明专利]米曲霉HG76及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及米曲霉，具体涉及米曲霉(Aspergillus oryzae)HG76及其在生产酿造酱油中的应用。

背景技术

酱油属于传统发酵调味食品，菌种是发酵的基础，其性能对酱油产量和质量影响甚大。目前，我国酱油酿造企业90％以上使用的是米曲霉(Aspergillus oryzae)沪酿3.042，该菌种具有生长快、产孢子多、酶系丰富、中性蛋白酶活性高等优点，是酱油酿造的主要菌种。然而，在高盐稀态酱油发酵过程中，发酵液的pH值随着酱油发酵时间的延长逐渐降低，中性和碱性蛋白酶活力迅速下降，而酸性蛋白酶在米曲霉整个酶系中的表达量相对偏低。这一现象导致酱油的原料蛋白利用率和氨基酸转化率偏低，产品风味较弱。因此，米曲霉酸性蛋白酶活力偏低是提高我国高盐稀态发酵酱油行业原料利用率和产品质量的关键因素。

由于传统的诱变育种的饱和效应和基因工程筛选标记在食品安全方面的担忧，米曲霉菌种改良必须考虑采用其他途径。在细胞杂交基础上发展起来的原生质体融合技术具有简便、高效和安全的特点，通过多轮重组可将亲本的优良性状进行组合，辅助合理的筛选程序，可快速获得目标菌株。针对米曲霉酸性蛋白酶活力偏低的缺陷，将黑曲霉的酸性蛋白酶基因通过基因组重组的途径转移至米曲霉基因组，并高效表达，可获得了高活力酸性蛋白酶曲霉融合子菌株。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术存在的上述缺陷，提供米曲霉HG76及其应用。

本发明所提供的米曲霉菌菌株是(Aspergillus oryzae)HG76，该菌株已于2010年06月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏编号为CGMCC No.3916。

米曲霉(Aspergillus oryzae)HG76 CGMCC No.3916的菌落呈圆形，菌落形态和颜色偏似A.oryzae HN3042，呈圆形，质地疏松，初期菌落中间白色，四周边缘呈透明射线状。菌落刚形成时，仅中间一点呈白色，以后随菌落长大，白色范围也逐渐扩大。随菌落长大，菌落的中心点先呈黄绿色，然后黄绿色向四周扩展。成熟菌落为黄绿色，有时为淡黄绿色，HG76菌丝分枝较粗，分枝较少，孢子囊松散。该菌株具有较高水平的蛋白酶活力，特别是酸性蛋白酶活力，为1605u/g(相比于出发菌A.oryzae HN3042提高了85.12％)，且其中性蛋白酶活仍有3303u/g(相比于出发菌A.oryzae HN3042降低了0.09％)。

本发明将米曲霉和黑曲霉进行原生质体融合获得的优质米曲霉菌。与现有技术相比具有如下优点和效果：本发明提供了一株米曲霉菌(Aspergillus oryzae)HG76CGMCC No.3916。试产实验结果证明该菌株遗传稳定性好，所制备的成曲酸性蛋白酶和中性蛋白酶活力高，发酵制备酱油产量高、能耗低。本发明的菌株将在酿造酱油生产中发挥重要作用，应用前景广阔。

蛋白酶酶活的测定

蛋白酶活力测定按Folin-酚法，具体操作为：

(1)标准曲线的制作：称取适量L-酪氨酸，105℃烘干至恒重，溶于0.1mol/L NaCl水溶液，配成1mg/mL的标准酪氨酸母液。制备系列稀释液，其浓度分别为20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL和100μg/mL。将表中所加溶液量同时缩小10倍，按标准程序进行操作。

(2)样品的酶活测定：取种曲适当稀释后的酶液100μL，40℃水浴中预热2min，再加入同样预热的酪蛋白溶液100μL，精确保温10min，然后立即加入200μL 0.4mol/L三氯乙酸终止反应，继续置于水浴中保温20min，残余蛋白质12000rpm离心10min，取100μL上清按标曲操作程序，测定其中酪氨酸含量，以40℃下每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸定义为1个蛋白酶活力单位。酸性蛋白酶的测定为pH 3.6的醋酸-醋酸钠缓冲液，中性蛋白酶的测定为pH 7.0的磷酸缓冲液。酶活计算公式为：