[发明专利]杉木体细胞胚胎发生及植株再生方法

说明书

技术领域

本发明涉及林业中的种苗繁殖生物技术领域，具体涉及一种诱导杉木优树杂交组合的未成熟合子胚胚性胚柄细胞团(Embryonal Suspensor Mass，简称ESM)离体增殖，发育成完整体细胞胚并再生植株的方法。

背景技术

杉木(Cunninghamia lanceolata(Lamb.)Hook)隶属杉科(Taxodiaceae)杉木属(Cunninghamia)，是我国特有的常绿针叶树种之一。杉木生长快，干形通直圆满，又以良好的材性，美观的木材纹理著称，用途十分广泛，是我国重要的商品用材造林树种。自1960年代以来，杉木良种选育研究，已培育出一大批优良种源、家系和优良无性系供造林使用，为我国速生丰产林建设作出了重要贡献。但由于造林面积的迅速增加，社会上对杉木优良种苗的需求极为迫切。然而由于近10多年来受到气候异常和杉木种实害虫的危害，杉木种子园的种子产量，大小年的现象严重，良种种子产量和播种品质不稳定。杉木良种种苗的供应不足，严重地制约着杉木人工林的发展。因此，有必要研发杉木优良种质资源的无性快速繁殖。体细胞胚胎发生技术具有繁殖速度快，培养周期短，生产成本低等优势，这给解决杉木优良种苗的繁育瓶颈和商业化和工厂化生产提供了技术支撑。

被子植物体胚的发生和植株再生的思想，源于1902年Haberlandt提出的植物细胞具有全能性的概念，即植物体的每一个细胞都具有发育成为一个新个体的潜在能力。在人工培养条件下，植物体细胞可以诱导分化形成如有性生殖合子胚那样的胚状结构(胚状体)，进而通过覆被人工胚乳形成人工种子或直接再生形成完整的植株。由于植物每一个体细胞从理论上都存在诱导成胚的可能性，且繁殖速度快、不受地区、季节和灾害性气候等自然条件的限制；对于木本植物来说，不必等待漫长的有性世代，也不必像常规的无性繁殖那样需要充足的萌芽插条，一旦获得优良的材料，就可以比常规繁殖快数十倍甚至上百倍的速度繁殖优良种苗。

作为裸子植物的杉木，体胚的发生与被子植物的体细胞胚发生有着完全不同的途径和机理，成熟的种子以及由种子发育而来的植株，营养细胞转变为胚性细胞十分困难。但在针叶树种中，雌配子体受精后发育成种子的过程中有一部分珠心细胞处于未分化的阶段，在适当的培养条件下，可以利用裂生多胚特性，诱导体胚形成。Gupta等(1985，1995)报道过利用这一生物学特性，诱导出花旗松(Pseudotsuga menziesii)和湿地松(Pinus elliottii)的体胚，其大致可以分为四个步骤：胚性胚柄细胞团(ESM：Embryogenesis suspensor mass)的诱导、保持和增殖、体胚的成熟、萌发和植株再生，并证明该技术体系具有达到产业化的前景。

目前虽有杉木成熟种子萌发后的下胚轴诱导体胚发生的报道，但是只能在外植体上形成个别体细胞胚，存在诱导率低、数量少的问题，难以在生产上应用。国内外尚无利用杉木优树未成熟种子诱导ESM、通过液体增殖ESM、并诱导体胚发生这一间接体胚发生途径并实现植株再生的成功方法报道。

发明内容

发明目的：本发明的目的是针对当前杉木组织培养器官发生困难、植株再生率低、难以满足生产应用需要等问题，提供一种利用杉木优树的未成熟胚诱导胚性胚柄团形成，进而实现体细胞胚发生和再生杉木植株的方法，以期实现能够快速生产大批高质量的苗木，满足林业生产对优质杉木种苗的需求。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明以杉木优树未成熟胚为起始材料，在适宜的培养基上进行多步离体培养，长期维持未成熟胚ESM的裂生多胚发生能力，经过胚性愈伤诱导、维持、增殖、体胚成熟前期和成熟等阶段培养，获得体胚，再经萌发培养实现植株的再生。

一种杉木体细胞胚胎发生及植株再生方法，包括以下步骤：

(1)杉木未成熟种子胚的准备

每年的3月中旬前后，选择经后代测定表明优良的亲本，配置杂交组合。并于6月中旬开始，采集杉木杂交组合的球果，在解剖镜下观察杉木合子胚的发育进程。取发育至胚胎选择、优势胚、柱状胚和早期子叶胚阶段的杉木球果，迅速置于4℃条件下冷藏保存一周。在无菌条件下，剥取球果中的未成熟种子胚备用；由于不同杉木生长的气候区不同和年度间气象条件的变化，以解剖镜下观察到的胚胎选择阶段开始到早期子叶胚阶段为止均为合适的球果取样时间。

(2)ESM的起始诱导