[发明专利]农杆菌介导的油菜下胚轴转化专用培养基

说明书

技术领域

本发明涉及生化培养基领域，更具体地，是一种通过农杆菌介导的油菜下胚轴转化专用培养基。

背景技术

植物转基因受体系统是指选择合适的器官、组织或细胞进行转基因后，能通过组织培养或其它途径再生出新生植株的无性繁殖体系。因此，适宜的油菜转基因受体系统的建立，是创造转基因油菜的关键环节。众所周知，芸薹属油菜在转化过程中存在多种影响因素，如外植体、苗龄、预培养时间、浸染时间、菌液浓度、共培养时间等，都对浸染后的愈伤组织的形成存在各种不同的影响作用，其中，苗龄与转化后愈伤组织的形成关系密切，随着苗龄的增长，下胚轴在侵染后形成愈伤的能力大大减弱，下胚轴的端部不易膨大，易于溃烂并有黑色斑点附着或出现白化或褐化现象；下胚轴在预培养期间，随着培养时间的延长，在转化过程中由于细胞活跃分裂且结构紧密，对农杆菌的侵害具有较强的抗性；随着农杆菌菌液侵染时间的增加，下胚轴在转化后形成为愈伤的比率也会略有增加；随着共培养时间的延长，愈伤分化形成能力受阻，上述因素容易导致转基因油菜转化率低，传统的培养基克服不了上述诸多因素对油菜转化过程所造成的影响，从而导致油菜转化率收到限制。

Moloney等于1989年发现芸薹属植物种子萌发以后，切取带有1-2mm子叶柄末端切口处的细胞不但再生能力强，而且易被农杆菌感染和转化。近年来，国内外许多学者分别以油菜的子叶、下胚轴、茎段为受体进行基因转化，也有采用原生质体受体系统，以原生质体为受体虽能得到高度纯合体，但其再生及分化困难，转化频率低，且操作复杂(段英姿等，2003)。Pua等于1987年建立了油菜茎段再生体系，并以此为受体，转化率为10％。郎春秀等于1999年在油菜农杆菌转基因体系的建立及转PEP反义基因油菜研究中，所用外植体为培养8～10天的无菌苗下胚轴，外植体经农杆菌感染后共培养2天，转入含500mg/L的羧青霉素的MS培养基上，1周后转入含羧青霉素及潮霉素的MS培养基上，以后每2周继代一次，转化频率仅为2.75％。

发明内容

本发明目的在于提供一种农杆菌介导的油菜下胚轴转化专用培养基，具有促进油菜下胚轴外植体高效再生的特点。

本发明是通过如下技术手段实现的：针对油菜下胚轴转化的不同阶段需要不同化学成分的特点，以特定的基本培养基为基础，加入相应浓度的激素、抗生素等其他组分，配制而成适合不同阶段的特定培养基。

本发明的农杆菌介导的油菜下胚轴转化专用基本培养基(MS)，包括大量元素、微量元素、有机质、铁盐，其中，

所述大量元素的组成及浓度如下：

CaCl₂·2H₂O    (420-450)mg/L；

KH₂PO₄         (165-185)mg/L；

KNO₃           (1800-2000)mg/L；

MgSO₄·7H₂O    (360-380)mg/L；

NH₄NO₃         (1600-1700)mg/L；

所述微量元素的组成及浓度如下：

CoCl₂·6H₂O    (0.023-0.027)mg/L；

CuSO₄·5H₂O    (0.023-0.027)mg/L；

H₃BO₃          (6.0-6.4)mg/L；

KI             (0.81-0.84)mg/L；

MnSO₄·H₂O     (16.7-17.2)mg/L；

Na₂MoO₄·2H₂O  (0.24-0.26)mg/L；

ZnSO₄·7H₂O    (8.4-8.8)mg/L；

所述有机质的组成及浓度如下：

甘氨酸         (1.9-2.1)mg/L；

肌醇(环己六醇) (98.0-102.0)mg/L；

烟酸           (0.45-0.53)mg/L；

盐酸吡哆醇(VB₆)(0.46-0.53)mg/L；