[发明专利]一种高产L-丙氨酸的XZ-A26菌株及构建方法与应用

权利要求书

1.一种高产L-丙氨酸的XZ-A26菌株，保藏号为CGMCC No.4036，其具有发酵产生高浓度L-丙氨酸的能力，其是通过将嗜热脂肪地芽孢杆菌染色体上的L-丙氨酸脱氢酶基因整合在大肠杆菌ATCC 8739染色体的乳酸脱氢酶处，再依次敲除所得大肠杆菌染色体的丙酮酸甲酸裂解酶基因、乙醇脱氢酶基因、乙酸激酶基因、富马酸还原酶基因和丙氨酸消旋酶基因，然后在发酵罐中连续传代培养而得的基因工程菌。

2.权利要求1的保藏号为CGMCC No.4036的XZ-A26菌株的构建方法，包括下述步骤：(1)L-丙氨酸脱氢酶基因的整合：将大肠杆菌ATCC 8739的乳酸脱氢酶基因扩增并克隆到pEASY-T1克隆载体上，得质粒pXZ-A01；将含有卡那霉素基因Km和果聚糖蔗糖转移酶基因sacB的DNA片段连接至质粒pXZ-A01的DNA扩增片段上，得到质粒pXZ-A02；将质粒pXZ-A02的DNA扩增片段电转至带有pKD46质粒的大肠杆菌ATCC 8739，筛选卡那霉素抗性的菌落，得菌株XZ-A01；将扩增的L-丙氨酸脱氢酶基因连接至质粒pXZ-A01的DNA片段，得到质粒pXZ-A03；然后将质粒pXZ-A03的DNA扩增片段电转至带有pKD46质粒的XZ-A01，培养筛选在蔗糖中不能生长的菌落，得菌株XZ-A02；其中，乳酸脱氢酶基因ldhA的扩增引物、质粒pXZ-A02的DNA扩增引物以及质粒pXZ-A03的DNA扩增引物为核苷酸序列表中序列3和序列4，质粒pXZ-A01的DNA扩增引物为核苷酸序列表中序列5和序列6，L-丙氨酸脱氢酶基因扩增引物为核苷酸序列表中序列1和序列2；

(2)依次敲除上述所得大肠杆菌染色体的丙酮酸甲酸裂解酶基因、乙醇脱氢酶基因、乙酸激酶基因、富马酸还原酶基因和丙氨酸消旋酶基因；

丙酮酸甲酸裂解酶基因的敲除：将菌株XZ-A02的丙酮酸甲酸裂解酶基因扩增并克隆到pEASY-T1克隆载体上，得质粒pXZ-A04；将含有卡那霉素基因Km和果聚糖蔗糖转移酶基因sacB的DNA片段连接至质粒pXZ-A04的DNA扩增片段上，得到质粒pXZ-A05；将质粒pXZ-A05的DNA扩增片段电转至带有pKD46质粒的菌株XZ-A02，筛选卡那霉素抗性的菌落，得菌株XZ-A03；将质粒pXZ-A04的DNA扩增片段进行磷酸化处理后自连得到质粒pXZ-A06；然后将质粒pXZ-A06的DNA扩增片段电转至带有pKD46质粒的XZ-A03，培养筛选在蔗糖中不能生长的菌落，得菌株XZ-A04；其中，丙酮酸甲酸裂解酶基因的扩增引物、质粒pXZ-A05的DNA扩增引物以及质粒pXZ-A06的DNA扩增引物为核苷酸序列表中序列7和序列8，质粒pXZ-A04的DNA扩增引物为核苷酸序列表中序列9和序列10；

乙醇脱氢酶基因、乙酸激酶基因、富马酸还原酶基因和丙氨酸消旋酶基因的敲除：按照丙酮酸甲酸裂解酶基因的敲除方法，以所得菌株XZ-A04为起始原料进行乙醇脱氢酶基因的敲除，得到菌株XZ-A06；然后以XZ-A06为原料进行乙酸激酶基因的敲除，得到菌株XZ-A08；再以XZ-A08为原料进行富马酸还原酶基因的敲除，得到菌株XZ-A10；再以XZ-A10为原料进行丙氨酸消旋酶基因的敲除，得到菌株XZ-A12；

其中，所用乙醇脱氢酶基因的扩增引物、质粒pXZ-A08的DNA扩增引物以及质粒pXZ-A09的DNA扩增引物为核苷酸序列表中序列11和序列12，质粒pXZ-A07的DNA扩增引物为核苷酸序列表中序列13和序列14；

乙酸激酶基因的扩增引物、质粒pXZ-A11的DNA扩增引物以及质粒pXZ-A12的DNA扩增引物为核苷酸序列表中序列15和序列16，质粒pXZ-A10的DNA扩增引物为核苷酸序列表中序列17和序列18；

富马酸还原酶基因的扩增引物、质粒pXZ-A14的DNA扩增引物以及质粒pXZ-A15的DNA扩增引物为核苷酸序列表中序列19和序列20，质粒pXZ-A13的DNA扩增引物为核苷酸序列表中序列21和序列22；

丙氨酸消旋酶基因的扩增引物、质粒pXZ-A17的DNA扩增引物以及质粒pXZ-A18的DNA扩增引物为核苷酸序列表中序列23和序列24，质粒pXZ-A16的DNA扩增引物为核苷酸序列表中序列25和序列26；

(3)在发酵罐中连续传代培养步骤(2)所得菌XZ-A12得到菌株XZ-A26。