[发明专利]建兰花叶病毒外壳蛋白基因原核表达蛋白及其制备和应用

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种建兰花叶病毒(CymMV)外壳蛋白基因原核表达蛋白及其制备和应用。

(二)背景技术

建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus，CymMV)是东南亚兰花生产中蔓延最广的病毒病之一(Korotieieva et al.，2004)，发病非常普遍且无需专门传播媒介，接触传染迅速，给花卉生产带来巨大损失。大面积的田间生产和贸易中需要方便、快捷的检测方法，以及时阻隔病原物的扩散。目前利用分子免疫学的方法因其具有的快速、特异性强的特点，被广泛地应用于动植物病毒检测中。在检测过程中往往需要制备特异性强的抗体作为检测试剂，通常病毒在病组织中含量低，一方面难以获得大量高纯度的病毒，另一方面利用提纯病毒制备的抗血清中常含有寄主蛋白的抗体，易导致假阳性反应(邓丛良等，2005)。但是可以利用病毒核酸基因在大肠杆菌菌株中大量表达蛋白，通过蛋白的富集和纯化，可以利用其免疫获得特异性强的抗血清，达到上述检测要求，提高检测的灵敏度。

(三)发明内容

本发明目的在于提供一种建兰花叶病毒(CymMV)外壳蛋白基因原核表达蛋白及其制备和应用。

本发明采用的技术方案是：

一种建兰花叶病毒(CymMV)外壳蛋白基因原核表达蛋白，具有SEQID No.1所示的氨基酸序列：

mgeptpipaatysaadptsapkladlaaikyspvtssiatpeeikaitqlwvnnlglpadtvgtaaidlarayadvgasksatllgfcptkpdvrraalaaqifvanvtprqfcayyakvvwnlmlatndppanwakagfqedtrfaafdffdavdstaalepaewqrrptdreraahsigkygalarqriqngnlitniaevtkghlgstntlyalpap pte。

本发明还涉及制备所述原核表达蛋白的方法，所述方法包括：将编码所述原核表达蛋白的目的基因CymMVCP插入原核表达载体，获得重组表达载体转化至大肠杆菌中，得到基因工程菌经诱导培养，获得所述建兰花叶病毒外壳蛋白基因原核表达蛋白；所述目的基因CymMVCP具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。

在已知本发明原核表达蛋白序列及其编码序列的情况下，本领域普通技术人员可以方便的获得本发明所述的原核表达载体并进一步获得本发明原核表达蛋白。优选的，所述原核表达载体为pET32c，目的基因CymMVCP的插入位点位于EcoR I和Hind III两个酶切位点之间。具体的，所述原核重组表达载体质粒图谱如图1所示。本发明采用的pET32c表达载体是个带有多克隆位点(Polylinker)的载体，多克隆位点的下游含有组氨酸标签，因此外源基因以融合蛋白的形式表达，同时表达的蛋白N端由载体序列编码的6×His标记的蛋白不影响病毒外壳蛋白的免疫原性，由此制备的抗血清特异性也不受影响。

含目的基因CymMV-CP的重组载体在大肠杆菌菌株细胞中的大量诱导表达后进行表达蛋白的富集，通过Ni-NTA Agarose蛋白纯化柱进行目的蛋白的纯化，通过Bradford进行蛋白浓度测定。同时对表达蛋白进行SDS-PAGE分离和可溶性检测，对相应大小的目的蛋白条带进行Western-blotting免疫原性分析，获得了高纯度高浓度可溶性的CymMV外壳蛋白基因原核表达蛋白，可直接作为抗原免疫动物进行抗血清制备，为CymMV检测提供制备特异抗体的原料。

本发明还涉及所述的原核表达蛋白作为抗原在制备CymMV抗血清中的应用。

本发明的有益效果主要体现在：提供了一种建兰花叶病毒(CymMV)外壳蛋白(CP)基因的原核表达蛋白及其制备和应用，利用该原核表达蛋白作为抗原可以得到特异性强的抗血清，为进一步研制CymMV的快速检测试剂盒提供了基础。

(四)附图说明

图1为含建兰花叶病毒外壳蛋白基因的原核重组表达载体pET32c-CymMV-cp；

图2为重组载体pET32c-CymMV-cp的PCR鉴定结果图；1：标准Mark；2：CymMV RT-PCR扩增产物；3.重组质粒PCR产物；4.空白对照。

图3为原核表达的CymMV-CP蛋白的SDS-PAGE检测结果；1：非预染Mark；2：pET32c-CymMV-cp在大肠杆菌中的表达蛋白；3：纯化的pET32c-CymMV-cp在大肠杆菌中的表达蛋白；4：pET32c在大肠杆菌中表达的载体蛋白；