[发明专利]己烯雌酚残留的时间分辨免疫分析检测试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明属于免疫检测技术领域，涉及一种化学品污染残留的检测试剂盒及其制备方法，具体涉及一种检测己烯雌酚残留的时间分辨免疫分析试剂盒及其制备方法。

背景技术

己烯雌酚(diethylatilbestrol，DES)属于人工合成激素，己烯雌酚(简称DES)为第一个口服有活性的人工合成雌激素，化学名为1，2-2-双(4-2-羟苯基)21，22二乙基乙烯，俗名乙底酚，为无色结晶或白色结晶性粉末，是目前国内医学临床最为广泛应用的合成激素，其结构式如式(I)所示：

己烯雌酚在促进动物蛋白质的合成代谢、提高动物日增重和减少脂肪等方面效果明显。因此一直被作为一种动物生长促进剂用于猪、牛、羊、鸡等畜禽饲料中。作为一种动物饲料添加剂，己烯雌酚能够在动物源性食品中，如肝脏、肌肉、蛋、奶中残留，同时动物通过可通过代谢对周围环境造成污染和富集，可以通过食物链引起少儿的发育早熟和男性女性化，以及人体内激素失调，女性乳腺癌、卵巢癌等疾病。

20世纪70年代末，国际癌症研究机构(IARC)研究发现，己烯雌酚由于本身的致癌性，会对健康产生严重的威胁。同时对己烯雌酚的风险评估中发现，己烯雌酚对人体的生殖结构、生育能力、以及癌症的发生率和神经方面的问题均有较大影响，同时也严重影响人的免疫系统与免疫功能。己烯雌酚在动物性食品中的滥用，已引起国内外的广泛重视。目前，国内外各个国家均禁止己烯雌酚(DES)在动物生产中的应用。为了保证人们的身体健康，有效的遏制己烯雌酚的滥用，建立己烯雌酚的检测方法有非常大的意义。

目前，检测DES残留的方法主要有以下几种：高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱-质谱法(GC-MS)、液相色谱-质谱法(LC-MS)、薄层色谱法、毛细管区带电泳法(CE)以及免疫分析方法(IA)。仪器方法虽然灵敏精确，但需要昂贵的专业仪器，分析费时，成本较高。免疫分析方法具有简单、快速、灵敏及成本低的特点，可达痕量(μgkg^-1)水平，是目前世界各国推行并实施的一种高通量初筛方法，时间分辨免疫检测方法属于免疫分析方法的一种，其实际上是在荧光分析(FIA)的基础上发展起来的，是一种特殊的荧光分析。

时间分辨免疫分析(TRFIA)的基本原理是其采用了特殊的镧系金属即三价稀土离子(Eu³⁺、Tb³⁺、Dy³⁺、Sm³⁺)及螯合剂(代替荧光物质、同位素或酶)。标记蛋白质、多肽、激素、抗体、核酸探针或生物活性细胞，待反应体系(如抗原抗体反应、核酸探针反应、生物素亲和素反应、靶细胞与效应细胞的杀伤反应等)发生后，用时间分辨分析仪测定最后产物中的荧光强度，根据荧光值的强弱，判断体系中分析物的浓度，达到定量分析的目的。

时间免疫检测方法在国外已被广泛应用于临床检测，近年在许多新领域得到应用，如免疫组织化学、微阵列，并可用于双标记、三标记和四标记等多标记免疫分析。荧光免疫检测方法作为一项具有广阔发展潜力的新兴生物学技术，已经给标记免疫学带来一场革命。本发明对免疫检测技术进一步应用于食品中兽药残留的快速检测提供一种新途径。

但目前尚无采用时间分辨免疫分析法检测己烯雌酚的相关技术报道，更没有一种适合进行己烯雌酚时间分辨免疫分析检测的试剂盒，以便于实现高灵敏度、操作简单的大批量快速检测。

发明内容

本发明的一个目的是克服现有技术的不足，提供一种检测己烯雌酚残留的时间分辨免疫分析检测试剂盒。

本发明的另一个目的是提供所述检测己烯雌酚残留的方法，高灵敏度、操作简单，能大批量快速检测。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

提供一种检测己烯雌酚残留的时间分辨免疫分析检测试剂盒，包括包被了己烯雌酚抗原的酶标板、己烯雌酚抗体、镧系元素标记羊抗兔或羊抗鼠抗体(二抗)；所述镧系元素包括Eu³⁺、Tb³⁺、Dy³⁺或Sm³⁺等稀土元素。

所述己烯雌酚抗原是碳二亚胺法(EDC)、活泼酯法(DCC、NHS)、混合酸酐法(氯甲酸异丁酯)将己烯雌酚半抗原与载体蛋白进行偶联得到的，所述载体蛋白包括牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、钥孔血蓝蛋白(KLH)等载体蛋白。