[发明专利]小蓬竹组织培养过程中外植体的消毒方法

说明书

技术领域

本发明属于竹类组织培养技术，具体地说是涉及一种小蓬竹组织培养过程中外植体的消毒方法。

背景技术

小蓬竹(Drepanostachyum Luodianense(Yi et R.S.Wang)Keng f.)系禾本科竹亚科镰序竹属竹种，又名“藤竹”，是中国特有种，在《中国物种红色名录》中被列为极危种。目前只在贵州的罗甸、平塘及长顺有栽培或有野生分布，常成片生长于海拔600～1000m的石灰岩裸露石山上。它的竹材柔韧可编凉椅和农具，也可作为造纸原料；形态优美，是良好的园林绿化竹种，并在环境恶劣的喀斯特地区生长良好，能耐干旱和瘠薄，对增强土壤的固土、保水、保肥能力效果十分显著，是喀斯特地区的适生性物种，在喀斯特生态系统中对水源涵养、水土保持、养分平衡等生态功能发挥着重要作用，具有很高的生态效益。

竹类的生殖周期长，很少开花结实，难以获得大规模繁殖的种子。而传统的移竹、埋鞭、竹枝扦插等繁殖方法存在消耗种竹多、种苗运输不便、劳动强度大、繁殖系数低等问题。采用组织培养的方法效率高，条件可控，生长快，周期短，重复性强，可进行周年试验或生产等优点，可以快速繁殖苗，适合竹子的工厂化百苗。

迄今为止，国内外竹子组织培养工作取得了很大的进展，但还是存在着许多的问题，如何通过有效的消毒方法降低外植体的污染率，就是需要首先解决的问题。与其他植物相比，竹子外植体消毒这一环节较为困难，很难达到理想的灭菌效果。这与竹类植物的特殊形态结构有关。竹类植物的表皮细胞具有致密的乳突及较厚的角质层，乳突表面蜡质状的物质及乳突间嵌附着的尘埃和各种菌类的孢子等，均阻碍了消毒液的渗透，从而影响外植体的充分灭菌。若选用杆芽、枝芽做外植体，中空坚硬的竹秆也导致外植体切割困难，细菌和真菌孢子容易从中空部位进入竹秆内部组织，造成后续污染。在外植体消毒时，消毒时间的控制也是一个重要问题，时间太短不能杀死细菌病毒，时间太长在杀死病菌的同时也会对植物造成伤害，引起褐变，影响外植体的诱导与增殖。因此，寻找有效的灭菌方法，减少污染瓶的丢弃，对于降低种苗生产成本和实现工厂化生产具有很重要的意义。

目前国内对小蓬竹研究最多的是小蓬竹的群落结构、多样性、水土保持功能、土壤种子库、叶面积指数以及其栽培技术研究应用等领域，而在组织培养方面尤其是外植体消毒方法的研究还是空白。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种小蓬竹组织培养过程中的一个重要环节，即外植体的消毒方法，以克服小蓬竹繁殖困难，和组织培养过程中成活率低的问题。

植物组织培养通常按以下步骤：

一、培养基的配制和灭菌：本发明实验所用培养基为通用的MS培养基，培养基配制后在24h内必须进行灭菌，通常采用的灭菌方法为高压灭菌法，其原理是通过加热，在密闭的高压锅内随着水蒸气压力的不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之升高。

二、外植体的处理及消毒

消毒的目标是：既要消灭材料上的病菌，又不损伤植物材料。

三、外植体的接种

无菌操作实验室中使用的无菌操作设备是超净工作台。接种前应进行地面的清洁卫生工作，用75％乙醇喷雾喷洒接种室，擦拭超净工作台台面，培养皿、酒精灯和其他工具也要事先放在超净工作台上，一起用紫外灯照射20min。操作前要用酒精擦洗手，操作中要经常用酒精擦洗手。不准讲话，亦不准对着操作区呼吸，以免口腔中所带的微生物污染材料、培养基和用具。操作中可采用250或500mL的广口瓶，放入95％的酒精，以便对操作工具进行消毒。在无菌操作时，把镊子、剪子、解剖刀等浸入95％的酒精中，使用之前取出在酒精灯火焰上灼烧灭菌。灼烧接种工具，待冷却后在酒精灯附近打开培养基瓶口，立即将所取的外植体迅速置入固体培养基中。在接种时，不能用生锈的解剖刀，动作要敏捷，随切随接，减少伤口在空气中暴露的时间。盖瓶盖前应将瓶口在火焰上烧一下，再将盖子也在火焰上烧一下，然后盖上。每次重新操作都要把工具在火焰上消毒。

四、植物组织培养：

培养条件为：光照强度1200Lx，每日光照12h，温度25～27℃。从接种完起每天观察其生长和污染情况，30天后记录结果，统计其污染数、成活数，进行分析得出最佳方案。