[发明专利]一种转录水平基因表达调控的方法及应用

说明书

技术领域

本发明属于生物医学和分子生物学领域，尤其是分子生物学中基因调控技术领域。具体涉及一种利用小双链RNA进行转录水平调控基因表达的方法。

背景技术

目前，基因调控技术尤其是RNA干扰技术早已被广泛应用到生物医学研究领域。小双链RNA（double-stranded RNA,dsRNA）可以高效、高特异性地阻断体内特定基因表达，促使目的基因mRNA降解，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型，即称为RNA干扰（RNA interference, RNAi），或称转录后基因沉默技术（Post-transcriptional Gene Silencing ,PTGS)。目前这些技术已经被广泛应用到生物医学研究领域，成为一种简单、有效的代替基因敲除的遗传工具。然而，目前的RNA干扰技术都是在转录后水平（也就是在mRNA水平上）降解目的基因mRNA或者阻遏目的基因mRNA的翻译从而发挥相应的基因沉默作用，而未包括转录水平的基因沉默，更未涉及到小RNA介导的转录水平基因上调或者激活领域。

发明内容

本发明的目的是提供一种转录水平基因表达调控的方法。具体涉及一种利用小双链RNA进行转录水平调控基因表达的方法。

具体而言，本发明的一种转录水平基因表达调控的方法，其特征在于，其包括步骤：

首先，在基因组DNA序列上（尤其在基因启动子区域和内含子区域）筛选并确认目标基因的作用靶点；然后，设计针对该作用靶点的特异siRNA，microRNA或shRNA；并且将靶序列特异性的小双链RNA转染进入细胞内，最后，通过PCR和Western blotting方法检测目的基因的表达变化以及通过相应生物学技术观察研究作用细胞所发生的功能性以及形态学等的改变。

本发明中，所述的作用靶点主要分布在目的基因的DNA序列上，包括目的基因的启动子区域，内含子，外显子区域，以及DNA的反义转录本上。

本发明中，所述的靶序列特异性的小双链RNA包括siRNA，shRNA，化学或者生物化学修饰后的siRNA，构建到相关质粒中的shRNA等。

本发明中，所述的靶序列特异性的小双链RNA主要是通过转染试剂（如脂质体转染试剂）或者慢病毒、逆转录病毒感染系统转导进细胞内的。

本发明中，所述的靶序列特异性的小双链RNA进入细胞内以后主要通过Exportin-5等细胞内在转输体系或者病毒介导进入细胞核内的。

本发明中，所述的特异siRNA或shRNA能够导致目标基因部分沉默；或者下调靶序列转录，最终导致基因部分下调或者完全沉默。

本发明中，所述的特异siRNA或shRNA能够诱导目标基因部分上调；或者上调调靶序列转录，最终导致基因部分上调或者完全激活。

本发明中，所述的特异siRNA的 3'端包括[dT][dT]。

本发明中，所述的特异siRNA是人工合成或者从细胞、组织中分离纯化获得。

本发明中，将该方法应用于靶基因后导致该靶基因在转录水平部分下调或者完全沉默；部分上调或者完全激活；从而起到在转录水平调控目的基因表达进而调控相关基因功能的作用。

 本发明中，所述shRNA即短发夹RNA。在RNAi感染过程中,产生dsRNA的一个有效方法就是在体内表达一个短发夹RNA分子,这种shRNA包含两个短反向重复序列(其中一个与目的基因互补),中间由一个loop序列分隔,组成发夹结构。

本发明的转录水平基因表达调控的方法可以理解为：提供针对哺乳动物细胞的特异基因，转染或导入靶点特异性的小双链RNA(包括siRNA或shRNA等)进入细胞核内；结果导致细胞内靶基因表达激活或上调；沉默或者下调。