[发明专利]某种梭菌D-塔格糖3-差向异构酶的核苷酸序列及其应用

说明书

【技术领域】：本发明属于生物技术领域和遗传工程领域，涉及从一种梭菌(Clostridiumcellulolyticum)中克隆D-塔格糖3-差向异构酶(DTE)基因的核苷酸序列及其应用。将该基因与不同表达载体连接，转入到细菌、酵母、植物或动物中，利用其编码的DTE生产D-阿洛酮糖的方法和应用。

【背景技术】：近年来发现了一类低热量、具有多生物学功能的单糖及其衍生物，由于在自然界中存在量极少，学术界把它们称为稀少糖(Rare Sugar)。随着人们对这类糖的逐步了解，以阿洛酮糖与塔格糖为核心的功能性稀少糖研究得到迅速的发展。研究表明，阿洛酮糖的甜味类似于蔗糖，易溶于水，不参加体内代谢，无热量；同时还具有许多独特的生理学功能。例如，使用D-阿洛酮糖代替蔗糖等传统甜味剂开发生产的牛乳布丁，具有更高的自由基清除和还原能力(Y.Sun，etal，2006，Biosci.Biotech.Biochem.，70：2859-2867)。因此，阿洛酮糖等稀少糖可以作为特殊人群理想的蔗糖替代品，在食品、保健品及医药品领域有着十分重要的应用价值。

目前，生产稀少糖的技术主要包括化学合成法、提取法和生物转化法。但稀少糖在自然界中的含量极低，提取法明显不适宜稀少糖的大规模生产；化学合成法不仅成本高、产量低，而且会产生比较严重的环境污染。生物转化法可以利用自然界中广泛存在的单糖或富含某些单糖的加工副产物为原料，不仅成本较低，而且转化效率要远远高于前两种方法，是规模化制备功能性稀少糖的重要技术手段。

日本的研究学者Izumofi于2002年建立了稀少糖的生物转化生产策略，即Izumoring方法，该方法中利用酮糖差相异构酶(ketose epimerase)、醛糖异构酶(aldose isomerases)和多元醇脱氢酶(poly dehydrogenase)进行所有单糖及糖醇之间的相互转化，从而利用廉价的原料制备各种稀少糖(K.Izomuri，2006，J.Biotechnol.，124：717-722)。Izumoring策略提示给我们D-阿洛酮糖的生物转化方法，即利用食品工业中加工副产物淀粉为原料经过现有成熟工艺获得D-果糖，再通过D-塔格糖-3-差相异构酶(D-tagatose 3-epimerase，DTE)的作用获得D-阿洛酮糖。该方法利用自然界中广泛存在的廉价原料生产阿洛酮糖，大幅降低了成本，为D-阿洛酮糖的工业化大规模生产奠定了理论基础。

日本香川大学稀有糖研究中心首次发现了DTE酶。该小组在研究假单胞菌Pseudomonascichorii ST-24的D-山梨糖酵解过程中，发现了一种新型的酶，该酶的最适底物为D-塔格糖，遂将其命名为D-塔格糖-3-差相异构酶。该酶能够催化己酮糖之间的差相异构反应，如D-塔格糖和D-山梨糖，D-果糖和D-阿洛酮糖之间的相互转化(K.Izomuri，et al，1993，Biosci.Biotech.Biochem.，57：1037-1039)。研究人员分离纯化了该酶，对其N-末端氨基酸序列进行了质谱测序，进而获得了该酶的基因序列。随后，韩国希杰第一制糖株式会社的Oh等人从根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens ATCC 33970)中克隆得到了新型的DTE基因，并在大肠杆菌中进行了异源表达(H.J.Kim，et al，2006，Appl.Environ.Microbiol.，72：981-985)。通过对酶动力学以及酶活性质的研究发现，该酶的最适底物并不是D-塔格糖，而是D-阿洛酮糖，于是将该酶的名称改为D-阿洛酮糖-3-差相异构酶(DPE)。该研究发现已于2006年申请了国际专利。我国江南大学的Zhang等人从鱼塘淤泥中分离纯化得到的类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides SK001)中克隆得到了DTE的基因，并对重组DTE的性质进行了进一步的研究(L.Zhang，et al，2009，Biotechnol.Lett.，31：857-862)。但到目前为止，有专利或文献报道的DTE基因只有以上三种，发现新型的DTE基因将是D-阿洛酮糖生物转化法生产的关键。

【发明内容】：本发明的目的之一是提供从梭菌Clostridium cellulolyticum中分离的编码D-塔格糖3-差向异构酶的核苷酸序列。

本发明的目的之二是提供该核苷酸序列所编码的D-塔格糖3-差向异构酶多肽。

本发明的目的之三是提供含有该基因核苷酸序列与异源调节序列连接，进行功能性表达的重组表达载体。