[发明专利]与苯亚甲基丙酮合成相关的酶及其编码基因与应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种与苯亚甲基丙酮合成相关的酶及其编码基因与应用。

背景技术

覆盆子酮，又名悬钩子酮(raspberry ketone)，化学名为4-对羟基苯基-2-丁酮，(4-(4-hydroxyphenyl)-2-butanone)，是一种经过美国食用香料制造者协会(FEMA)和欧洲理事会(COE)共同认可使用的一种具有幽雅果香香韵的安全食用香料，其FEMA编号为2588，属于国家海关承认、产业政策鼓励发展的高新技术产品，其被广泛用于食品、化妆品及医药中间体的合成。作为覆盆子果实特征性香味物质，在覆盆子植物中含量低并且资源非常有限，从植物中提取天然覆盆子酮是不经济的，天然提取的覆盆子酮成本高达每公斤2万美元。

在自然界中，覆盆子酮广泛存在于悬钩子属植物覆盆子中。覆盆子，今称树莓，为悬钩子属，蔷薇科，半灌木，小桨果类。覆盆子可做水果食用，其红熟果称树莓果，口感香、甜、酸，可鲜食，在欧美是一种极具营养价值和经济价值的高端水果，在中国少为人知，仅在东北地区有少量栽培，市场上比较少见。覆盆子同时具有很高的药用价值；其绿果经炮制制成传统中药覆盆子，《本草纲目》等文献记载具有“气味甘，平，无毒”，有益肾固精缩尿壮阳作用。

覆盆子酮是一种酚类化合物，其生物合成来源于聚酮化合物生物合成途径，苯亚甲基丙酮合酶(Benzalacetone synthase(BAS))(EC 2.3.1.-)催化4-香豆酰辅酶A与丙二酰辅酶A分子通过一步脱羧缩合反应生成苯亚甲基丙酮(p-hydroxyphenylbut-3-ene-2-one)，之后苯亚甲基丙酮再还原酶的催化下直接生成覆盆子酮。BAS是植物类型III聚酮合酶(PKS)超家族成员，在构建具有重要药理价值的一系列苯丁烷类化合物及其衍生物的C₆-C₄分子骨架方面具有重要的功能。BAS是覆盆子酮生物合成途径的关键酶和限速酶，是利用基因工程技术分子调控覆盆子酮生物合成的靶点。BAS在覆盆子植物中一直未得到分离，但在蓼科植物掌叶大黄(Rheum palmatum)中得到分离。

发明内容

本发明的一个目的是提供与苯亚甲基丙酮合成相关的酶及其编码基因与应用。

本发明提供的蛋白质，人工合成，命名为PcmBAS，是如下1)或2)的蛋白质：

1)由序列表中的序列4的氨基酸残基序列组成的蛋白质；

2)将序列表中的序列4氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与苯亚甲基丙酮合成相关的由1)衍生的蛋白质。

上述序列4由389个氨基酸残基组成，上述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

所述蛋白质的编码基因PcmBAS也是本发明保护的范围。

所述编码基因为如下1)-5)中任一所述的DNA分子：

1)序列表中序列3所示的DNA分子；

2)序列表中序列3自5’末端第4位到第1167位核苷酸所示的DNA分子；

3)序列表中序列3自5’末端第1位到第1167位核苷酸所示的DNA分子；

4)在严格条件下与1)或2)或3)限定的DNA序列杂交且编码与苯亚甲基丙酮合成相关的蛋白所示的DNA分子；

5)与1)或2)或3)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码与苯亚甲基丙酮合成相关的蛋白所示的DNA分子。

上述序列3由1167个核苷酸组成，OFR的序列为序列3的自5’末端第1-1167位核苷酸序列。

所述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜。

含有上述编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系、表达盒或重组病毒也是本发明保护的范围。

所述重组载体为将上述编码基因插入载体pET-30b(+)的NdeI和SalI识别位点间得到的重组载体。

扩增上述编码基因全长或任一片段的引物对也是本发明保护的范围；所述引物对如下所示：一条引物序列如序列表中序列5所示，另一条引物序列如序列表中序列6所示。

上述蛋白质在合成苯亚甲基丙酮中的应用，上述编码基因在合成苯亚甲基丙酮中的应用都是本发明要保护的范围。所述合成苯亚甲基丙酮为体外合成苯亚甲基丙酮。

本发明另一个目的是提供一种制备苯亚甲基丙酮的方法。